尼古丁通过蛋白激酶B和糖原合成酶激酶-3调节γ网络振荡

贺小龙，成祥林，钱锋，路承彪

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)



尼古丁通过蛋白激酶B和糖原合成酶激酶-3调节γ网络振荡

贺小龙，成祥林，钱锋，路承彪

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

[摘要]目的：探讨尼古丁调节海马γ网络振荡的机制。方法：健康雄性Wistar大鼠，取其脑组织制备海马脑片,制备好的海马脑片放入恒温(30～32℃)界面浴槽式灌流系统孵育。灌流液是充有混合气体(95%O2+5%CO2)的人工脑脊液(pH：7.35～7.50，流速2～3 mL/min)。孵育1h后，采用细胞外微电极方式记录。应用红藻氨酸激动剂(Kainate)对大鼠海马脑片灌流，诱导γ(20～60Hz)网络振荡。分组加入mTOR(Mammalian target of rapamycin)激酶阻断剂雷帕霉素，糖原合成酶激酶-3 (Glycogen synthase kinase-3, GSK-3) 阻断剂SB415286，蛋白激酶B阻断剂Triciribine，待γ网络振荡稳定后再加入尼古丁，观察三者对尼古丁增强γ网络振荡作用的影响。结果：雷帕霉素不能阻断尼古丁增强γ网络振荡的效应，SB415286和Triciribine能阻断尼古丁的效应。结论：尼古丁可能通过激活糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)和蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)来增强γ网络振荡。

[关键词]γ网络振荡；尼古丁；雷帕霉素；SB415286；Triciribine

神经网络振荡是大脑网络神经元的节律性同步性活动，反映了网络环路的功能特征，是网络神经元信号同步输出的时间标识[1],与脑的高级功能如学习、记忆密切相关[2]。海马网络振荡活动按频率不同主要分为：4～12Hz(theta,θ)，13～30Hz(beta,β)和30～80Hz(gamma,γ)[3]。最近研究表明1μM尼古丁能增强γ网络振荡[4]，近年来研究表明在离体培养神经元细胞中，NMDA受体通过磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)途径调节细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和蛋白激酶B(Akt)的磷酸化[5,6]。我们最近还发现NMDA阻断剂完全阻断了尼古丁的作用，表明尼古丁通过激活NMDA受体而调节了神经网络活动[4]。在培养的海马神经细胞内，尼古丁能激活依赖cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)及其下游的ERK1/2[7]。在海马脑片齿状回，PKA, ERK，PI3K参与了尼古丁诱导的LTP，而依赖钙离子的蛋白激酶2(CAMKII)并未参与[8]。尽管报道表明尼古丁影响PI3K-Akt信号通路的上游分子，而尼古丁对PI3K-Akt信号通路的下游分子的作用并不清楚。PI3K-Akt信号通路下游的一个重要激酶是mTOR激酶，后者的导致糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)激活，而Akt对GSK-3β存在抑制作用[9]。Triciribine分别是是一种特异性Akt抑制剂，对其他激酶如PI3K、PKC、PKA、ERK1/2没有作用[10]；雷帕霉素是mTOR激酶阻断剂。mTOR激酶主要参与调节细胞周期，最近研究发现其可能还与淀粉样毒性蛋白的产生和Tau蛋白的磷酸化有关[11]； SB415286是GSK-3β阻断剂,对其他蛋白激酶几乎没有活性[12]。淀粉样毒性蛋白能通过抑制PI3K/Akt信号通路而激活GSK-3β，被激活的GSK-3β将介导Tau蛋白的磷酸化[13]。因此，我们拟应用PI3K-Akt信号通路下游的三个重要激酶的阻断剂Triciribine，雷帕霉素，SB415286来研究尼古丁调节γ网络振荡的细胞内机制。

1材料与方法

1.1实验动物

洁净级Wistar大鼠，4周，雄性，共18只，分为3组，每组6只，体重140g，由武汉动物实验中心购买的4对大鼠所繁殖。

1.2仪器与试剂

人工脑脊液成分：KCl 3mmol/L，CaCl22mmol/L，NaCl 126mmol/L，MgSO42mmol/L，Glucose 10mmol/L，NaH2PO41.25mmol/L，NaHCO324mmol/L。切片脑脊液成分：Sucrose 225mmol/L，Glucose 10mmol/L，KCl 3mmol/L，NaHCO324mmol/L，MgSO46mmol/L，NaH2PO41.25mmol/L，CaCl20.5mmol/L。戊巴比妥钠从国药集团化学试剂有限公司购买。尼古丁，红藻氨酸(Kainate)，雷帕霉素(RAPA)，SB415286，Triciribine从Sigma公司购买。LEICA VT1200S振动切片机购买于Leica(英国)；NL125，126FILTERS信号滤波器，Micro1401信号处理器，NL104(A.C.PREAMP)信号放大器和NL106(AC-DC AMP)信号放大器购买于Digitimer有限公司；Spike 2软件购于CED(剑桥，英国)，TC324B温控装置购于Warner(USA)。

1.3实验方法

1)局部场点位记录对实验动物进行腹腔麻醉，打开胸腔暴露心脏，用眼科剪剪破右心耳，在心尖处用预冷0℃)的切片脑脊液(pH:7.35～7.50)经左心室灌流至全身，观察到四肢迅速变白时，快速断头取脑，制备脑片(水平位)，脑片厚度控制在400μm。切好的脑片放孵育灌中用已接通混合气(95%O2+ 5%CO2)的人工脑脊液(pH:7.35～7.50，流速为2～3mL/min)灌流，75%的大鼠海马脑片与灌流用的人工脑脊液接触，并且灌流液体保持32℃。脑片孵育1h后将玻璃微电极至于海马CA3区，加入200nM Kainate，20～30min后即开始出现γ网络振荡，1.5～2.0h后达到稳定状态，随后分组加入雷帕霉素(100nM)，SB415286(10μmol)，Triciribine(5μM)，待药效稳定后加入尼古丁(1μmol)，观察γ网络振荡的改变。

2)电生理记录的数据分析将大鼠脑片置于孵育槽1h候后，可以观察到良好的脑片呈淡黄色，且形态学上完整。在海马脑片的右侧CA3区放置一个记录电极-参比电极双电极记录模式，将充满人工脑脊液的玻璃微电极(电阻：2～5MΩ)，放置于小鼠海马CA3区放射层与锥体细胞层交界处，通过NL104放大器将生物信号2倍放大，通过NL106放大器(AC-DC AMP)进一步放大500倍，然后信号经由NL125，NL126(FILTERS)进行(2～200Hz)滤波。最后通过CED1401ADC板将数据以2kHz的采样速率转换为数字信号，在计算机上显示并记录。分析数据使用Spike 2软件(CED，剑桥，英国)。

1.4统计学分析

2结果

2.1尼古丁能增强γ网络振荡

大鼠海马脑片在没有加任何药物的情况下，并没有明显的生物学信号(图1A1)，当加入200nM红藻氨酸(KA)后，可诱导出明显γ网络振荡(图1A2)，再加入尼古丁后γ网络振荡功率谱增加，验证了尼古丁能增强γ网络振荡这一结论。

2.2雷帕霉素对γ网络振荡的影响

当红藻氨酸诱导的γ网络振荡达到稳态后，使用100nM雷帕霉素(RAPA)，γ振荡功率谱提高了(12.0±5.2)%(图2B1、B2、C，P>0.05，配对t检验，n=6)；再应用尼古丁后，γ振荡功率谱较加入雷帕霉素后相比提高了(17.5±1.9)%(图2B2、B3、C，P<0.01，配对的t检验，n=6)。以上结果表明：雷帕霉素不能阻断尼古丁提高γ振荡功率的作用。

2.3SB415286对γ网络振荡的影响

当γ网络振荡达到稳态后，使用SB415286(10μmol)，γ振荡功率谱提高了(11.9±8.1)% (图3B1、B2、C，P>0.05，配对t检验，n=5)；再加入尼古丁后γ振荡功率谱较加入SB415286后相比提高了(5.4±1.8)%(图3B2、B3、C，P<0.05，配对的t检验，n=5)。以上结果表明：SB415286能阻断尼古丁提高γ振荡功率的作用。

注：A1是未加红藻氨酸(KA)时记录到的细胞外场电位1S原始曲线；A2是应用KA(200nM)后记录到的场电位1S原始曲线；A3是在A2的基础上应用尼古丁(1μM)后记录到的场电位1S原始曲线。B1是未加KA时记录到的能谱图；B2是应用KA(200nM)后记录到的能谱图；B3是应用1μM尼古丁后记录到的能谱图。图1　尼古丁对γ网络振荡的影响

注：A1是应用KA(200nM)后记录到的场电位1S原始曲线；A2是在A1的基础上应用雷帕霉素(100nM)后记录到的场电位1S原始曲线；A3是在A2的基础上应用1μM尼古丁后记录到的场电位1S原始曲线。B1～B3是应用KA，雷帕霉素，尼古丁后记录到的能谱图。C柱状图是应用KA、雷帕霉素、尼古丁后功γ网络振荡的功率谱。图2　雷帕霉素对γ网络振荡的影响

注：A1是应用KA(200nM)后记录到的场电位1S原始曲线；A2是在A1的基础上应用SB415286(10μM)后记录到的场电位1S原始曲线；A3是在A2的基础上应用尼古丁(1μM)后记录到的场电位1S原始曲线。B1～B3是应用KA、SB415286、尼古丁后记录到的能谱图。C柱状图是应用KA、SB415286、尼古丁后γ网络振荡的功率谱。图3　SB415286对γ网络振荡的影响

2.4Triciribine对γ网络振荡的影响

当γ网络振荡达到稳态后，使用5μM Triciribine，γ振荡功率谱提高了(18.2±6.0)% (图4B1、B2、C，P<0.05，配对t检验，n=5)；再加入尼古丁后，γ振荡功率谱较加入Triciribine后相比提高了(2.8±3.2)%(图4B2、B3、C，P>0.05，配对的t检验，n=5)。以上结果表明：Triciribine能提高γ振荡功率，并且能阻断尼古丁的作用。

注：A1是应用KA(200nM)后记录到的场电位1S原始曲线；A2是在A1的基础上应用Triciribine(5μM)后记录到的场电位1S原始曲线；A3是在A2的基础上应用尼古丁(1μM)后记录到的场电位1S原始曲线。B1～B3是应KA、Triciribine、尼古丁后记录到的能谱图。C柱状图是应用KA、Triciribine、尼古丁后γ网络振荡的功率谱。图4　Triciribine对γ网络振荡影响

3讨论

低浓度尼古丁(1μM)在海马脑片CA3区能增强持续的γ网络振荡，加入NMDA受体阻断剂后，尼古丁对γ网络振荡的作用消失[4]。由此可见NMDA调节尼古丁的γ网络振荡增强作用。我们结果也显示，Akt或GSK-3β的抑制阻断了尼古丁的γ网络振荡增强作用，但是mTOR的抑制对尼古丁的γ网络振荡增强作用无影响，表明尼古丁通过激活NMDA受体，导致一系列的细胞内信号(激酶)激活，包括PI3K-Akt-GSK-3β信号通路的激活，而调控了γ网络振荡。

有趣的是，在一定条件下Akt抑制剂Triciribine本身增强了γ网络振荡，这种现象提示Akt可能直接参与γ网络振荡的调控。也有报道表明Triciribine 是一个DNA合成的抑制剂，这种现象是否与其对DNA合成的抑制有关待进一步探讨。

mTOR的抑制对尼古丁的γ网络振荡增强作用并无影响，mTOR是GSK-3β上游信号，mTOR的抑制会导致GSK-3β的活性下降，和应用GSK-3β的阻断剂应该有相似作用。说明mTOR的作用的复杂性和细胞种类的特异性。

Akt或者其他蛋白激酶如PKA能磷酸化GSK-3β并阻断其介导的细胞凋亡[14,15]。所以抑制Akt和GSK-3β应该会出相反的结果。然而使用上述两个受体的阻断剂后，尼古丁的效应都被阻断。最近研究表明酒精能同时激活AKT和GSK-3β[16,17]，是否尼古丁能通过类似的机制产生作用，待进一步研究。

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[编辑]方多

[收稿日期]2016-01-01

[作者简介]贺小龙(1988-)，男，硕士生，主要从事神经病学研究工作；通信作者：路承彪，354277140@qq.com。

[中图分类号]R338.2

[文献标志码]A

[文章编号]1673-1409(2016)18-0001-05

[引著格式]贺小龙，成祥林，钱锋，等.尼古丁通过蛋白激酶B和糖原合成酶激酶-3调节γ网络振荡[J].长江大学学报(自科版)，2016，13(18)：1～5.