尼古丁降解菌的分离鉴定和初步特性研究

江吉红，商弘颖，吴立飞，陈连升，马 云

（浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310032）

尼古丁降解菌的分离鉴定和初步特性研究

江吉红，商弘颖，吴立飞，陈连升，马 云

（浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310032）

从浙江省某农药厂的活性污泥中分离得到一株尼古丁高效降解细菌，根据表型特征、生理生化特性和16S r DNA序列系统发育分析，将其鉴定为假单胞菌属，命名为TW5.该菌株能以尼古丁为唯一碳源、氮源和能源生长，当接种量为5%时，菌株TW5在含500 mg／L尼古丁的基础盐液体培养基中降解尼古丁，12 h后降解率约为100%.该菌株降解尼古丁的最适pH为6.5～7.0，最适温度为30℃.研究表明，该菌株具有很强的尼古丁降解能力，可用于处理含尼古丁废弃物.

尼古丁；降解；生物特性；假单胞菌

尼古丁（nicotine），俗称烟碱，分子式为C10H14N2，是多种烟草中所特有的、最重要的生物碱，占烟草重量的1%～2%，是影响烟叶品质的重要因素之一，同时也是烟叶和卷烟的主要有害成分之一.

尼古丁是一种精神药品，人类长期保持着吸食烟草的习惯.然而，尼古丁是烟叶和烟气中主要致癌成分N-亚硝胺（TSNA）的重要前体物［1］，过量吸入会抑制人体中枢神经，麻痹心脏，严重者会有致命的危险［2］；尼古丁也是一种环境有毒物质，在常温下，纯净的尼古丁是无色或淡黄色、味苦、有强烈刺激性的透明的油状液体，在空气中极易被氧化成暗灰色.烟气环境中就含有大量的尼古丁，目前在我国的烟叶中尤其是在上部烟叶中尼古丁的含量普遍过高，这给烟叶的安全生产带来很大的挑战.同时，烟草在加工过程中会产生大量的高浓度尼古丁废料，这种废料被认为是“有毒的危险废物”［3］，若直接排放到环境中，则对环境造成很大的危害.因此使得不断控制和降低卷烟尼古丁含量成为国际烟草业发展的必然趋势，同时也是降低吸烟危害的重要途径之一，这对于维护人类健康有着深远的意义.

较之物理、化学的方法去除烤烟中的尼古丁，微生物法具有操作简单、易改造等独特的优势，越来越受到人们的关注.早在20世纪40年代，就已经有关于微生物降解尼古丁的报道.目前国内外的研究者已经分离得到多株尼古丁降解菌，主要有：假单胞菌属［4－7］、节 杆 菌 属［8］、纤 维 单 胞 菌 属［9］、苍 白 杆 菌属［10］、芽孢杆菌属［11］等.这些微生物多数能利用尼古丁为唯一碳源、氮源和能源进行生长，它们主要通过吡啶途径［8－12］、吡咯途径［13－14］、脱甲基化途径［15－16］将尼古丁转化为羧酸和氨基酸，为微生物的生长提供碳源、氮源和能源，从而达到降解有毒废物的目的.

本研究中从杭州农药厂分离筛选得到一株尼古丁高效降解菌，通过对其进行菌种鉴定和降解特性的研究，发现该菌株可能存在全新的降解途径，这为更全方面的了解尼古丁的降解途径提供了依据，也为构建具有更高降解效率和能耐受更高尼古丁浓度的工程菌建立了基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富集用的活性污泥采自杭州农药厂.

基础 盐 培 养 基 （MM）：NH4NO31.0 g／L，K2HPO41.5 g／L，KH2PO40.5 g／L，MgSO40.2 g／L，NaCl 1.0 g／L，加入自行配置的微量元素溶液1 mL，pH 7.0.

基础盐固体培养基：基础盐培养基中加入1.5%～2%的琼脂粉.

LB培养基：蛋白胨10.0 g／L，酵母膏5.0 g／L，NaCl 10.0 g／L.

固体LB培养基：LB培养基中加入1.5%～2%的琼脂粉.

以上培养基与缓冲液均经过高压蒸汽灭菌（121℃，25 min）.

尼古丁原药购自伊普瑞斯（纯度为99%），使用前将尼古丁原药溶于无菌水中，按所需浓度添加到培养基中.

抗生素购自上海捷倍思公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成.

1.2 试验方法

1.2.1 尼古丁降解菌的分离与纯化

取上述活性污泥5 g放于100 mL的基础盐培养基中，其中基础盐培养基中尼古丁的质量浓度为500 mg／L，30℃，150 r／min摇床培养7 d后，以5%接种量转接至新的含尼古丁的基础盐培养基中，连续富集、转接5次，尼古丁的浓度逐渐提高到1 000 mg／L.取富集后的培养液经梯度稀释后（10－3，10－4，10－5，10－6）涂布于含1 000 mg／L的尼古丁基础盐固体培养基平板上，30℃培养.待平板上出现单菌落后，挑取单菌落划线于LB固体培养基中，反复划线进行纯化，将纯化后的菌落接种至LB固体斜面培养基中保存.

1.2.2 菌种的鉴定

16S r DNA序列和系统发育分析：采用细菌16S r DNA的通用引物（上海英骏生物技术有限公司合成），其正向引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′，反向引物序列为：5′-CGGCTACCTTGTTACGACTTC23′［17］进 行 16S r DNA 的 PCR扩增.PCR产物的纯化和测序由上海英俊公司完成.测序结果利用Blast在GenBank基因库中进行同源性比较和鉴定.将16S r DNA序列和与其同源性高的序列用DNASTARver.7.1.0中的 multiple sequence alignment software CLUSTAL W分析，并用Megalign构建系统发育树.

1.2.3 尼古丁降解实验

（1）检测方法

尼古丁残留量的检测：本实验采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养液中尼古丁的残留量.降解液经过离心后（10 000 r／min，10 min，4℃），于4℃保存备用.高效液相色谱（HPLC）检测条件：流动相为V（CH3OH）∶V（H2O）＝10∶90，其中水中含有1 m M H2SO4，分析柱为Grace Alltima C18 Column（4.6 mm×250 mm，5μm），流速为0.6 mL／min，进样量为20μL，柱温为30℃.

生物量的检测：2 mL培养液经过离心（10 000 r／min，10 min，4℃）获得菌体，用2 mL的基础盐培养基洗涤3次，然后用2 mL相同的基础盐培养基重新悬浮，在600 nm处测定其OD值（紫外可见分光光度计JASCO V-550型）.

（2）培养条件对降解菌生长和降解能力的影响

尼古丁起始质量浓度的影响：将培养16 h的菌体（5 mL菌液离心所得）接种到100 mL不同尼古丁起始浓度（200，500，1 500，4 000 mg／L）的基础盐培养基中，摇床振荡培养（150 r／min，30℃）.连续测定细胞的生长和尼古丁的降解情况.

培养温度的影响：将培养16 h的菌体（5 mL菌液离心所得）接种到100 mL含尼古丁（500 mg／L）的基础盐培养基中，在150 r／min和不同温度（23，30，37，45℃）下培养，连续测定尼古丁的降解情况.

起始pH的影响：将培养16 h的菌体（5 mL菌液离心所得）接种到100 mL含尼古丁（500 mg／L）的基础盐培养基中，在不同起始pH（5.5，6.0，6.5，7.0，8.0，9.0），150 r／min，30 ℃条件下培养12 h，测定尼古丁的降解情况.

2 结果与讨论

2.1 菌种的鉴定

形态及生理生化特征：选择在含尼古丁的基础盐固体培养基中长势最好的一株作为研究对象，命名为TW5.菌株TW5在LB固体培养基上生长7 d后，菌落边缘扩散，呈淡黄色，表面光滑，湿润，不透明.能利用葡萄糖、淀粉、吐温40为唯一碳源，不能利用β－环糊精、乙酸钠.甲基红试验（M.R）、过氧化氢酶为阳性，V P、氧化酶为阴性.菌株对氨苄具有抗性，而对氯霉素、卡那霉素和链霉素均没抗性.

16S r DNA序列分析：根据16S r DNA序列构建系统发育树（图1），序列同源性分析表明，确定菌株TW5为Pseudomonas sp.

图1 菌株TW5的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree by strain TW5

2.2 不同条件下尼古丁降解实验

用（OD）600值和尼古丁残留量表示菌株TW5生长和降解尼古丁的情况.

尼古丁初始浓度对菌株TW5的生长和降解影响分别如图2，3所示，从图2中我们可以看出菌株TW5在尼古丁质量浓度为200～1 500 mg／L的浓度范围内都能生长良好，并且延滞期较短，从图3中我们可以看出菌株TW5在9 h内对质量浓度为200 mg／L和500 mg／L的尼古丁的降解率接近100%，对于质量浓度为1 500 mg／L的尼古丁，12 h内的降解效率能达70%以上，24 h能将其降解接近完全.实验过程中，我们发现当尼古丁质量浓度为4 000 mg／L时，菌株TW5仍能生长，而且菌株TW5能以尼古丁为唯一碳源、氮源和能源生长，是尼古丁的高效降解菌，对处理高浓度的尼古丁废水有非常好的效果，可用于尼古丁废水的集中修复.

温度对菌株TW5降解尼古丁的影响如图4所示，结果显示温度对TW5降解尼古丁的影响较大，菌株TW5在30℃以前，随着温度的升高，降解效率增大，当超过37℃时，降解率快速下降；降解的最适温度为30℃.

不同初始PH值对菌株降解尼古丁的影响如图5所示，结果显示尼古丁的降解在pH 9.0时最差；pH 6.5～7.0之间较好，降解率都达到95%以上；降解的最适pH为6.5～7.0.

图5 不同初始pH值对TW5降解尼古丁的影响Fig.5 Effect of pH on nicotine degrade by strain TW5

通过上述图表分析可知菌株TW5降解尼古丁的最佳条件为30℃，pH 6.5～7.0.经过12 h的培养，菌株对质量浓度为500 mg／L的尼古丁的降解效率接近100%，24 h内能将质量浓度为1 500 mg／L的尼古丁降解接近完全，最高耐受尼古丁的浓度为4 000 mg／L.目前国内外关于尼古丁的降解途径主要集中在吡咯途径、吡啶途径和脱甲基途径方面，而用菌株TW5在加有尼古丁的基础盐培养基中进行降解实验时，我们发现培养液的颜色会由无色慢慢变为绿色，最后变为酒红色，这显然与我们已知的尼古丁降解途径存在着差别，目前国内外学者研究的菌株在降解尼古丁的过程中具有这种颜色变化的非常少，对这种绿色的产物以及其代谢途径的研究也是非常少，菌株TW5中有可能存在着新的尼古丁降解途径，这有待于以后的深入研究.

3 结 论

从浙江省某农药厂活性污泥中筛到一株能以尼古丁为唯一碳源、氮源和能源的生长的假单胞属的菌株TW5，其降解尼古丁的最佳条件是30℃，pH为6.5～7.0，最高耐受尼古丁的浓度为4 000 mg／L.菌株TW5在降解尼古丁的过程中溶液颜色有绿色和酒红色产生，推测菌株TW5在降解尼古丁的过程中产生了绿色的代谢产物，有可能存在全新的尼古丁降解途径，这对研究尼古丁的降解途径有着非常重要的意义.

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Isolation and characterization of a nicotine-degrading bacterium

JIANG Ji-hong，SHANG Hong－ying，WU Li-fei，CHEN Lian-sheng，MA Yun
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhengjiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

A strain of bacterium designated as Strain TW5，capable of degrading nicotine efficiently，was isolated from sludge in a Hangzhou pesticide factory，Zhejiang province.Strain TW5 was identified preliminarily as Pseudomonas sp.based on its physiological and biochemical characters and the result of the 16S r DNA homologue sequence analysis.This bacterium could degrade approximately 100%of 500 mg／L nicotine in 12 h.Results of its degradation characteristics showed that the optimal pH and temperature for nicotine degradation were 6.5～7.0 and 30℃，respectively.TW5 showed high ability to degrade nicotine and has a potential strain for direct application in contain nicotine waste treatment.

nicotine；degradation；biological characteristics；Pseudomonas

X172

A

1006-4303（2011）06-0614-05

2010-09-03

国家自然科学基金资助项目（21007058）；浙江省自然科学基金资助项目（Y5100253）

江吉红（1985—），女，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事环境微生物研究，E-mail：jiang044189＠sina.com。通信作者：马云副教授，E-mail：mayun＠zjut.edu.cn.

（

陈石平）