肾小管上皮及肾脏局部病理改变对肾结石形成的临床价值分析

姚林 吴军

肾小管上皮及肾脏局部病理改变对肾结石形成的临床价值分析

姚林 吴军

目的 分析肾小管上皮及肾脏局部病理改变对肾结石形成的临床价值。方法 （1）取肾结石患者肾乳头活检标本（n=37），镜下观察其病理特点，并对比检测肾结石患者肾组织（n=37）及健康肾组织（n=21）骨桥蛋白、骨形成蛋白-2（BMP-2）、Ⅱ型胶原表达；（2）体外培养肾小管上皮细胞，以10 mM草酸或10 mM草酸+200 mg/L一水草酸钙（COM）结晶作用12 h，行Western Blotting检测其EN01及Cofilin-1蛋白的表达。结果 （1）肾乳头标本中钙斑出现率83.8%（31/37）、局部钙盐沉积出现率94.6%（35/37）；肾结石患者骨桥蛋白阳性表达，肾结石患者与健康人群肾组织BMP-2及Ⅱ型胶原均呈阴性。（2）10 mM草酸作用12 h后，肾小管上皮细胞EN 01表达明显上升、Cofilin-1表达明显下降（P＜0.05），10 mM草酸联合COM结晶作用后，上述变化更为明显（P＜0.05）。结论 肾脏局部钙盐沉积可能是肾结石形成的主要途径，且该途径与动脉钙化机制不同；草酸及COM结晶可能对肾小管上皮细胞产生毒性作用，影响其EN 01及Cofilin-1的表达，可能促进肾结石的形成。

肾结石；肾小管上皮细胞；钙盐沉积；肾脏

肾结石发病率约占5%[1]，随碎石技术的发展，其诊治均取得了有效突破，但约占1/2患者可能于8年内复发[2]，这表明现阶段临床尚缺乏有效的肾结石预防方案，而其根本原因可能与肾结石的形成机制尚不明确有关。既往有研究认为钙盐沉积、肾钙斑沉积可能与肾结石的发生与发展有关[3]，但钙盐沉积的具体机制尚不明确。基于此，本研究重点探讨了肾结石患者的钙盐沉积特点，并分析了高浓度尿石成分对肾小管上皮细胞的损伤对钙盐沉积的促进作用，具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 肾乳头活检标本及肾组织标本采集自2013年1月～2013年12月间上饶市立医院收治的37例肾结石患者，男女比例25︰12，年龄9～77岁，平均（43.5±10.2）岁；健康肾组织采集自21例肾癌患者，同期入院，男女比例17︰4，年龄44～71岁，平均（53.9±10.1）岁。人肾小管上皮细胞HK-2细胞株均购自华中科技大学同济医学院。

1.2 主要试剂与器械 （1）小鼠抗人OPN抗体、BMP-2抗体、Ⅱ型胶原抗体，均购自Sigma公司；SP试剂盒，DAB试剂盒购自武汉博士德；Vector 22红外光谱仪，购自Bruker；压片机，购自北京先锋世纪；（2）DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶等，均购自GIBCO公司；草酸、一水草酸钙等，均购自上海国药；二氧化碳孵育箱，购自美国Forma；高速离心机，购自上海安亭；酶标仪，购自芬兰LABSYSTEMS。

1.3 试验方法

1.3.1 局部病理观察 （1）所有肾结石患者行经皮肾镜取石碎石术治疗，于术中直视取肾乳头活检标本，先后行HE及茜素红染色，镜下分析钙盐沉积情况；（2）所有肾组织石蜡包埋切片，行免疫组化SP法检测其骨桥蛋白、BMP-2及Ⅱ型胶原表达情况，统计阳性率。

1.3.2 肾小管上皮病理改变 取HK-2细胞株体外培养，细胞长满后，培养液更换为无血清含钙DMEM培养液，划分为3组，各18份，分别不做特殊处理、加入终浓度10 mM草酸、同时加入10 mM草酸及200 mg/LCOM结晶，12 h后行Western Blotting检测EN 01及Cofilin-1浓度。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计学软件处理数据，计量资料采用“±s”表示，多组间对比行F检验及q检验；计数资料以百分数和例数表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 局部病理观察

2.1.1 镜下观察 肾结石患者肾乳头标本中钙斑出现率、局部钙盐沉积出现率均明显高于健康肾组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。钙盐沉积特点：在钙斑部位沉着浅、聚集多，远离钙斑部位及深部髓质沉着量明显较少；钙盐沉积少，则集中见于肾小管基底膜，部分向肾间质蔓延；电镜下可见钙盐沉积严重位置，其周围细胞超微结构破坏。

表1 钙斑及局部钙盐沉积情况对比[n（%）]

2.1.2 免疫组化分析 肾结石患者肾脏组织均呈骨桥蛋白阳性表达，阳性率明显高于健康肾脏组织（P＜0.05）；2组均未见BMP-2及Ⅱ型胶原阳性表达。见表2。

表2 肾脏组织骨桥蛋白、BMP-2及Ⅱ型胶原阳性表达情况[n（%）]

2.2 肾小管上皮病理改变 经草酸或草酸+COM结晶处理，肾小管上皮细胞EN 01表达明显上升，Cofilin-1表达明显下降（P＜0.05），且草酸+COM结晶处理后，上述蛋白表达量与单用草酸处理，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 肾小管上皮细胞EN 01和Cofilin-1半定量检测结果（xs）

表3 肾小管上皮细胞EN 01和Cofilin-1半定量检测结果（xs）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与单用草酸处理，bP＜0.05

处理方案例数EN 01Cofilin-1对照组180.22±0.030.78±0.04草酸180.54±0.03a0.29±0.05a草酸+COM结晶180.63±0.04ab0.18±0.03abF值25.31131.325 P值0.0000.000

3 讨论

肾结石病因复杂，目前多认为其可能与遗传、代谢、尿路局部因素、气候等多种因素有关[4]，且指出尿液中游离颗粒只有转换为固定颗粒，固定于尿管之中，才可形成结石，即肾结石的形成需要一个原发病灶[5]。有假说认为钙盐沉积是肾结石的早期病变，钙盐沉积形成肾钙斑可为结石提供生长基础，且肾钙斑穿透肾小管上皮细胞后，还可进一步促进结石的形成[6]。

该假说具备一定的科学性，但并未有效揭示含钙物质在肾脏局部沉积的机制。考虑到肾乳头的钙化成分与动脉硬化斑块成分相似，均多为羟基磷灰石，有学者认为肾脏的钙盐沉积可能与动脉粥样硬化机制相同，均为成骨反应[7]。但本研究并不支持此轮点，本例中肾结石患者肾组织中仅骨桥蛋白阳性，但BMP-2及Ⅱ型胶原均阴性，而后两者均为成骨性细胞标志蛋白。由此推测，肾局部钙盐沉积可能仅与骨桥蛋白的过表达有关，该蛋白确有一定成骨作用，在肾脏中多由亨利氏襻、近曲小管等分泌，在健康机体内有抑制肾脏结晶沉淀的功能[7]。然而肾结石患者肾小管上皮多受损伤，表面富含草酸钙晶体，过饱和的草酸钙晶体可能将骨桥蛋白包裹进去，形成潜在的晶体成核位点，导致肾结石的形成[8]。

由此推测，肾结石形成的主要原因之一可能为：高浓度尿石成份导致肾小管上皮细胞损伤，进一步导致上皮细胞分泌成骨样蛋白，或分泌特异因子，或在局部促发成骨性反应，导致钙盐沉积，再导致肾结石形成。虽然前述分析提示了局部促发成骨性反应的机制之一，但本研究同时显示，草酸及COM结晶还可导致肾小管上皮异常分泌释放其它蛋白，如EN 01及Cofilin-1。EN 01表达的上调可能表明细胞受损[9]，需要通过增加无氧代谢以自我保护；Cofilin-1则为细胞分裂必须蛋白，有解聚收缩环、促进细胞分裂的功能，其含量下降，表明肾脏局部细胞分裂存在缺陷[10]。然而上述蛋白是否间接影响肾结石的形成，尚需深入探讨，不过本研究结论已能够直接证实，尿中草酸及COM结晶能够使肾小管上皮细胞产生病理性改变，异常释放多种蛋白。

总之，本研究表明肾小管上皮及肾脏局部病理改变可能与肾结石的形成与发展有一定关系，值得深入探讨。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.2.008

江西 334000 江西省上饶市立医院外一科 （姚林 吴军）