荧光原位杂交法应用于胃癌Her-2基因检测及其临床意义

吴颖虹 王仁杰 柳万江 贾志红 张珏

荧光原位杂交法应用于胃癌Her-2基因检测及其临床意义

吴颖虹 王仁杰 柳万江 贾志红 张珏

目的 探讨荧光原位杂交法(FISH)应用于胃癌Her-2基因检测及其临床意义。方法 选取54例胃癌组织标本，采用免疫组化法(IHC)及FISH对标本中胃癌Her-2蛋白表达与基因扩增情况进行测定，并比较测定结果。结果 （1）FISH测定结果：14例表现为标本扩增，40例表现为标本无扩增，Her-2基因扩增率为25.93%；（2）IHC测定结果：10例Her-2表达为+++，8例Her-2表达为++，16例Her-2表达为+，20例Her-2表达为0，Her-2蛋白表达率为18.52%；（3）扩增符合率：Her-2蛋白表达为0时，Her-2扩增符合率为5.00%；Her-2蛋白表达为+时，Her-2扩增符合率为6.67%；Her-2蛋白表达为++时，Her-2扩增符合率为37.50%；Her-2蛋白表达为+++时，Her-2扩增符合率为90.00%；总符合率为25.93%，且呈现为正相关（P＜0.05）。结论 在胃癌筛查中，可将IHC作为初步筛查手段，而针对晚期胃癌患者则建议行FISH检测，以便进一步了解Her-2基因状态，为临床靶向治疗提供明确信息。

胃癌；Her-2基因；荧光原位杂交法；免疫组化法

胃癌是近几年来发病率较高的一种肿瘤疾病，并以每年新发

100余万的速度递增，而在新发病例中超过42%的病例为中国病例，加之其较高的死亡率，如今，我国已成为了胃癌发病率和死亡率均较高的国家[1]。随着对胃癌发病原因、机制等研究的深入，人类表皮生长因子受体2（Her-2）随之成为了胃癌靶向治疗的新焦点，Her-2是位于人类染色体17q12-21.3上的原癌基因，是表皮生长因子受体（EGFR）家族中非常重要的成员之一，其在细胞分化、生长以及增殖中均有参与，为此，Her-2基因表达有无表达，直接关系着胃癌靶向治疗药物的选择，特别是靶向性基因治疗。故对胃癌Her-2基因进行测定，了解其表达情况，对临床治疗、预后判断有着重要意义。鉴于此，本科室在课题研究中，采用免疫组化法(IHC)及荧光原位杂交法(FISH)对胃癌Her-2基因进行测定，并分析其临床意义。现将有关情况报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究胃癌组织标本均来自江西省景德镇市第二人民医院2013年1月～2015年12月接诊的54例胃癌手术患者，其中女21例，男33例，患者年龄55～73岁，平均年龄（65.23±2.15）岁。所有患者术前均未行放化疗治疗。

1.2 方法

1.2.1 FISH 取17号染色体着丝粒（CEP17），可将其标记为绿色，并将Her-2基因标记为红色。具体操作步骤为：取组织切片，依次对其进行脱蜡，无水酒精中室温10min去除二甲苯，梯度酒精脱水后，纯化水煮沸处理20min，室温晾干，在37℃条件下，行200mg/L胃蛋白酶反应，持续消化进行5～15min，多次SSC洗涤，再依次梯度酒精脱水，向其中加入探针混合液

10μL，85℃杂交仪行5min变性处理，37℃环境下行过夜杂交处理。采用0.3%NP-40/0.4×SSC66℃处理1min，采用

0.11 %NP-40/2×SSC室温环境下行1min处理，采用乙醇进行3min洗片处理，对其进行干燥处理，放置到10μLDAPI复染剂中进行复染处理，封片，静置于避光处，20min后取出，放置于荧光显微镜下观察。

1.2.2 IHC 取胃癌病理组织标本，采用中性甲醛固定，行常规石蜡包埋处理，切片，厚度4μm，运用IHCEliVision Plus二步法行染色处理，放置于高倍显微镜下观察10个视野，并将Her-2蛋白表达定位在细胞膜，阳性反应物呈现为棕黄色颗粒状。

1.3 评价标准

1.3.1 FISH评价标准 经荧光显微镜下对60个细胞进行计数，并对Ratio值进行统计，若Ratio值低于1.8即可视为阴性，这表明该样本并不存在Her-2基因扩增；若Ratio值控制在1.8～2.2范围内，则将细胞计数增加到100个或者再次进行FISH实验，并根据结果进行判定；若Ratio值超过2.2即可视为阳性，这表明该样本中存在Her-2基因扩增；若观察发现，红色信号点呈现为成簇扩增，同样也表明该样本为Her-2基因扩增阳性。

1.3.2 IHC评价标准 （1）0/阴性：细胞膜均未染色或者＜10%肿瘤细胞膜染色；（2）+/阴性：肿瘤细胞超过10%，细胞膜表现不完整，且呈现为弱染色；（3）++/不确定：肿瘤细胞超过10%，细胞膜表现轻度到中度完整；（4）+++/阳性：肿瘤细胞超过10%，细胞膜表现非常完整，且呈现为强染色。

1.4 统计学方法 本研究数据均以统计学软件SPSS15.0进行分析处理，运用Kendall行相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FISH检测结果 54例胃癌患者胃癌组织中，14例表现为标本扩增，40例表现为标本无扩增，Her-2基因扩增率为25.93%（14/54）。

2.2 IHC检测结果 54例胃癌患者胃癌组织中，10例标本测定结果Her-2表达为+++，8例标本测定结果Her-2表达为++，16例标本测定结果Her-2表达为+，20例标本测定结果Her-2表达为0，Her-2蛋白表达率为18.52%（10/54）。

2.3 FISH与IHC测定结果比较 Her-2蛋白表达为0时，Her-2扩增符合率为5.00%(1/20)；Her-2蛋白表达为+时，Her-2扩增符合率为6.67%(1/15)；Her-2蛋白表达为++时，Her-2扩增符合率为37.50%；Her-2蛋白表达为+++时，Her-2扩增符合率为90.00%。两种方法检测结果总符合率为25.93%（14/54），且呈现为正相关（r=0.761，P＜0.05）。见表1。

表1 FISH基因扩增与IHC蛋白表达扩增结果比较（n）

3 讨论

随着医学技术的快速发展，分子生物学技术也日渐成熟，并在生命科学领域得到了广泛运用，在帮助人类进一步了解细胞生活活动中发挥了重要作用[2]。随着对细胞生长、分化、增殖以及癌变等认识的逐渐深入，关于参与其变化的调节分子机制的研究也随之增多，这使得本研究从更新的角度和层面了解胃癌的病变和发展过程，同时也将分子生物学技术逐渐发展到了肿瘤临床诊断、预后判断等方面[3]。

自1987年首次报到Her-2过表达的预后意义以来，Her-2基因成为了临床应用较为广泛的肿瘤标记物[4]。当人体Her-2基因呈现为大量扩增时，必然会导致蛋白产物P185呈现为过表达，从而致使Her-2受体异源二聚体形成数量快速增多，致使细胞内酪氨酸激酶的活性呈现为快速增多，并致使酪氨酸自身磷酸化，致使多种信号转导途径快速激活，出现细胞大量增殖的情况，引起癌变反应[5]。在卵巢癌、肺腺癌以及乳腺癌等恶性肿瘤疾病中，Her-2蛋白或者基因扩增均呈现为过表达。有文献报道表示[6]，在胃癌中，Her-2基因扩增阳性率为7.1%～42.6%，而过表达率为6.8%～34%。而Her-2基因非常容易接近抗体，故将其作为肿瘤免疫治疗靶位是目前学界公认观点。

目前，在Her-2检测中，主要采用FISH与IHC两种方法，其中IHC由于其操作简单方便，且成本低廉，同时通过显微镜能够观察到肿瘤组织中Her-2阳性变化，故被视为Her-2检测的首选方法。但IHC在检测中极易受到各方面因素的干扰，并且方法相对较为间接，故其准确性和稳定性有待进一步考察[7]。FISH是一种分子遗传学检测技术，作为分子生物学技术中逐渐成熟起来的新技术，FISH是一种用于胃癌诊断的分子水平分析技术，其主要通过细胞表型、组织病理学和基因型三方面的结合，来实现对肿瘤疾病的诊断，具有较高灵敏度、准确性和稳定性，其测定结果更为客观[8]。根据本研究结果显示，FISH检测Her-2基因扩增率为25.93%，该结果表明，FISH在Her-2基因扩增阳性率明显更高，且呈现为正相关。

综上所述，在胃癌Her-2状态筛查中，FISH与IHC均具有一定的临床应用价值，能够客观、准确地反应出Her-2状态，但实际运用中，建议将IHC作为初步筛选方法，针对晚期胃癌患者则建议采用FISH作进一步检查。

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[4] 李明新，于忠和，范晋楠.实时荧光PCR检测胃癌石蜡组织中Her-2表达的研究[J].医学综述，2012，18（9）：1418-1420.

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[7] 眭维国，欧明林，陈洁晶，等.荧光原位杂交法与免疫组织化学法检测乳腺癌HER-2基因扩增及蛋白表达的对比研究[J].实验与检验医学，2010，27（1）：16-18，46.

[8] 何中元，王桂芝，秦文华.胃癌组织HER-2基因的检测用于靶向治疗[J].医药论坛杂志，2014，34（9）：36-37.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.22.011

景德镇市级科技计划项目（20152SFZC050）

江西 333000 江西省景德镇市第二人民医院病理科 （吴颖虹王仁杰 柳万江 贾志红 张珏）

王仁杰 E-mail：wlj3526@126.com