内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞TNF-α、IL- 6表达的影响

袁雪明　刘陆滨▲　赵志香.佳木斯大学附属第二医院口腔医院牙体二科，黑龙江佳木斯　54002；2.佳木斯大学，黑龙江佳木斯　54002



内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞TNF-α、IL- 6表达的影响

袁雪明1刘陆滨1▲赵志香2△
1.佳木斯大学附属第二医院口腔医院牙体二科，黑龙江佳木斯154002；2.佳木斯大学，黑龙江佳木斯154002

［摘要］目的研究内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞TNF-α、IL-6表达的影响。方法培养HPLFs细胞，将细胞分为LPS刺激0 mg/L（对照组）、1 mg/L（实验Ⅰ组）、10 mg/L（实验Ⅱ组），应用ELISA法检测IL-6、TNF-α因子的表达情况。结果LPS刺激6 h时，HPLFs中TNF-α、IL-6的表达量显示：Ⅰ、Ⅱ组显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。LPS刺激12 h时，HPLFs中TNF-α、IL-6的表达量显示：Ⅰ、Ⅱ组也显著高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。HPLFs细胞中TNF-α、IL-6的表达随LPS刺激浓度呈剂量依赖性；且对照组、及Ⅰ组、Ⅱ组经LPS刺激12 h的TNF-α、IL-6表达均显著高于刺激6 h，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。结论内毒素脂多糖（LPS）能够刺激人牙周膜成纤维细胞分泌TNF-α、IL-6炎症因子。

［关键词］内毒素脂多糖（LPS）；人牙周膜成纤维细胞；TNF-α；IL-6

▲通讯作者

△在读硕士研究生

革兰阴性菌的内毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是一种公认的重要的牙周病致病因子，研究发现，其具有调节细胞的生长、合成代谢，并刺激巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞等分泌IL-6、TNF-α等多种炎症介质的作用［1］。牙周膜成纤维细胞（human periodontal fibroblast，HPLFs）是牙周组织中数量最多的细胞，牙周膜成纤维细胞（HPLFs）在牙周组织健康中发挥着重要作用［2］。本实验旨在探讨经脂多糖刺激后的牙周膜成纤维细胞炎症因子IL-6、TNF-α表达情况，现报道如下。

1　材料与方法

1.1一般材料

DMEM培养液（Gibco，USA）；牛血清（Gibco，USA）；LPS从细菌Salmonella minnesota Re595中提取并保存。鼠SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒；CO2培养箱（Yamato，Japan）；超净工作台（苏州安泰空气技术公司）；倒置显微镜（广西梧洲市光学仪器厂）；酶标分析仪（Thermo corporation，USA）；多功能真彩色细胞图像分析管理系统（Media Cybernetics，USA）。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（R&D systems，美国），白细胞介素-6（IL-6）试剂盒（R&D systems，美国）。

1.2方法

1.2.1HPLFs的取材、体外分离和培养选择2013年1月～2014年1月我院因阻生齿而行拔除术中分离的新鲜健康牙周膜组织，入选患者共12例，其中男7例，女5例，年龄范围18～28岁，无龋病、牙周病和根尖周病，3个月内未使用抗生素类、激素类药物，无糖尿病史、心血管病史、吸烟史等。将牙周膜组织在超净台内剪碎，应用含有100 U双抗PBS缓冲液进行冲洗，去除表面的凝血块及残留物质，用2 U/mL的DispaseⅡ分散酶浸泡16～18 h，剥除牙周膜上皮组织，采用组织块法进行HPLFs的原代细胞培养，标准培养条件：37℃，950 mL/L空气，50 mL/L CO2，100%湿度，取第2～3代细胞进行实验。

1.2.2分组将培养的HPLFs细胞以5×105/孔密度接种于6孔板，加入适量DMEM培养液，培养至细胞生长达80%汇合后弃原培养液，对照组为不含LPS的20 mL/L胎牛血清DMEM，PBS缓冲液冲洗细胞2次，细胞用0.25%戊二醛固定。实验组加入预先配置的LPS，使其浓度分别为1 mg/L、10 mg/L，将细胞分为LPS刺激0 mg/L（对照组）、1 mg/L（实验Ⅰ组）、10 mg/L（实验Ⅱ组），分别于LPS刺激6 h和12 h后每孔加入1 mL Trizol进行细胞裂解，提取总RNA及合成cDNA。1.2.3 IL-6、TNF-α的检测加入LPS刺激6、12 h收集上清液150 μL，应用据ELISA间接夹心法检测IL-6、TNF-α因子的表达情况，按试剂盒说明严格操作。

1.3统计学方法

本研究数据分析采用SPSS12.0统计学软件进行分析，其中计量资料以（±s）表示，采用t检验，多组间比较进行方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞TNF-α表达的影响

见表1。LPS刺激6 h时，HPLFs中TNF-α的表达量显示：Ⅰ、Ⅱ组显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。LPS刺激12 h时，HPLFs中TNF-α的表达量显示：Ⅰ、Ⅱ组也显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。HPLFs细胞中TNF-α的表达随LPS刺激浓度呈剂量依赖性；且对照组、Ⅰ组、Ⅱ组经LPS刺激12 h的TNF-α表达均显著高于刺激6 h，差异具有高度统计学意义（P＜0.01）。

2.2内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞IL-6表达的影响

见表2。LPS刺激6 h时，HPLFs中IL-6的表达量显示：Ⅰ、Ⅱ组显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。LPS刺激12 h时，HPLFs中IL-6的表达量显示：Ⅰ、Ⅱ组也显著高于对照组，差异具有高度统计学意义（P＜0.01）。HPLFs细胞中IL-6的表达随LPS刺激浓度呈剂量依赖性；且对照组、Ⅰ组、Ⅱ组经LPS刺激12 h的IL-6表达均显著高于刺激6 h，差异具有高度统计学意义（P＜0.01）。

表1　内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞TNF-α表达的影响（±s，ng/L）

表1　内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞TNF-α表达的影响（±s，ng/L）

注：各组刺激6 h：F=23.539，P＜0.01；各组刺激12 h：F=31.532，P＜0.01；分别与对照组比较，t=23.643、45.213、51.364、45.321，*P＜0.01；分别与刺激6 h比较，t=8.342、19.235、94.342，#P＜0.01

组别　LPS刺激6 h　LPS刺激12 h对照组（0 mg/L）Ⅰ组（1 mg/L）Ⅱ组（10 mg/L）26.32±3.64 157.80±24.97*263.30±39.25*62.36±11.29#392.3±95.41*#428.27±71.32*#

表2　内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞IL-6表达的影响（±s，ng/L）

表2　内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞IL-6表达的影响（±s，ng/L）

注：各组刺激6 h：F=11.342，P＜0.01；各组刺激12 h：F=21.53，P＜0.01；分别与对照组比较，t=7.342、8.231、36.231、32.643，*P＜0.01；分别与刺激6 h比较，t=5.321、12.932、23.984，#P＜0.01

组别　刺激6 h　刺激12 h对照组（0 mg/L）Ⅰ组（1 mg/L）Ⅱ组（10 mg/L）21.63±4.22 62.27±11.39*83.11±13.26*38.23±5.38#112.62±23.75*#127.34±22.97*#

3　讨论

牙周炎症是以革兰阴性厌氧杆菌为主要致病菌的混合感染，革兰阴性厌氧杆菌的主要毒力因子之一是其细菌外膜成分脂多糖（LPS）。且研究发现，龈沟液中IL-6、TNF-α等细胞因子参与了牙周炎的炎症过程。

本实验采用LPS作为刺激源，检测重要炎症介质IL-6、TNF-α在体外培养牙周膜成纤维细胞（HPLFs）中的表达，以探讨LPS对牙周膜成纤维细胞的牙周炎症的作用［3-5］。牙周膜成纤维细胞是牙周组织内主要的细胞成分，近年来的研究表明，成纤维细胞可与脂多糖直接作用，作为免疫辅助细胞参与牙周组织的破坏过程，产生炎症细胞因子，介导炎症反应，参与牙周炎的发生和发展，在LPS引起的牙周炎组织病理损害过程中具有重要作用［6-8］。

TNF-α和IL-6是牙周炎病理发生的关键炎症因子，仅能够诱导巨噬细胞和牙周膜成纤维细胞产生前列腺E2，活化破骨细胞，促进骨吸收，抑制胶原合成，加速牙周组织破坏，还可以增强血管的通透性诱导白细胞移出，在牙周组织的局部炎症破坏中具有重要作用［9-11］。

本研究通过培养HPLFs细胞，将细胞分为LPS刺激0 mg/L（对照组）、1 mg/L（实验I组）、10 mg/L（实验Ⅱ组），应用ELISA法检测IL-6、TNF-α因子的表达情况。研究结果显示，LPS刺激6 h时，1mg/L LPS 和10 mg/L LPS两组中的IL-6、TNF-α水平分别显著高于对照组，LPS刺激12 h时，1 mg/L LPS和10 mg/L LPS两组中的IL-6、TNF-α水平也分别显著高于对照组，差异具有高度统计学意义（P＜0.01），说明HPLFs细胞中TNF-α、IL-6的表达随LPS刺激浓度呈剂量依赖性；且对照组、Ⅰ组、Ⅱ组经LPS刺激12 h的TNF-α、IL-6表达均显著高于刺激6 h，差异具有高度统计学意义（P＜0.01），说明LPS能通过刺激HPLFs产生炎症细胞因子，促进牙周炎症的发生和发展。

HPLFs可能作为免疫激活辅助细胞，在LPS作用下产生TNF-α、IL-6等细胞因子，参与局部免疫反应，在牙周炎发生发展中发挥重要作用。HPLFs获得免疫辅助细胞活性的同时，可能会丧失其多向分化潜能活性，影响牙周组织代谢和修复过程［12-14］。

综上，我们认为，内毒素脂多糖（LPS）能够刺激人牙周膜成纤维细胞分泌TNF-α、IL-6炎症因子，参与了牙周炎的发生和发展过程。脂多糖的细胞毒作用直接影响着牙周膜成纤维细胞的生长与增殖，还能刺激巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞等分泌白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α等多种炎性细胞因子，对炎性反应起决定作用［15］，因此，研究阻断细胞因子的分泌对未来预防和治疗牙周病具有十分重要的意义，值得进一步深入开展研究。

［参考文献］

［1］Czuszak CA，Sutherland DE，Billman MA，et al. Prestanglandin E2 potentiates interleukin-1 induced interleukin-6 production byhuman 6n6wl fibroblasts［J］. J Clin Periodontol，1996，23（1）：635-640.

［2］王珺，欧龙，罗芸，等.茶多酚对脂多糖诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡及炎症因子的影响［J］.中华老年口腔医学杂志，2015，13（2）：80-81.

［3］Nebel D，Arvidsson J，Lulqvist J，et al. Differential effects of LPS from escherichia coli and porphyromonas gingivalis on IL-6 production in human periodontal ligament ceils［J］. Acta Odontologica Scandinavica，2013，71（3-4）：892-898.

［4］陈焱，许红苗，莫文元，等.抗肿瘤坏死因子单抗对脂多糖诱导的人牙周膜成纤维细胞TRAF-2的调控作用［J］.中国药物与临床，2014，14（7）：891-892.

［5］李霞，肖明振，余擎，等.脂多糖干预后成牙本质细胞系MDPC-23中肿瘤坏死因子受体相关因子6基因表达的研究［J］.中国药物与临床，2010，10（5）：493-495.

［6］Shadnoush M，Shaker Hosseini R，Mehrabi Y，et al. Probiotic yogurt affects pro-and anti-inflammatory factors in patients with inflammatory bowel disease［J］. Iran J Pharm Res，2013，12（4）：929-936.

［7］Sfakianakis A，Barr CE，Kreutzer DL. Localization of the chemokine interleukin -8 and interleukin -8 receptor in htmaan gingival and cultured gingival keratinocytes［J］. J Periodont Res，2002，37（2）：154-160.

［8］李会英，赵满琳，陈惠珍，等.中药黄芩苷对脂多糖刺激人牙周膜成纤维细胞分泌肿瘤坏死因子-α的影响［J］.现代口腔医学杂志，2006，20（5）：531-532.

［9］张凤秋，吴织芬，万玲，等.牙龈卟啉菌和大肠杆菌内毒素对人牙周膜细胞分泌IL-6，TNF-α的影响［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2002，12（2）：76-78.

［10］王岚，夏佳佳，刘琪，等.脂多糖对人牙周膜干细胞增殖及炎性因子表达的影响［J］.华西口腔医学杂志，2013，31（3）：286-287.

［11］吴莹莹，刘洪臣. TNF-α，IL-1β及IL-6与糖尿病及牙周炎之间的关系［J］.中华老年口腔医学杂志，2011，9（2）：117-121.

［12］许丽华，武海春，董福生，等. LPS刺激对体外培养人牙龈成纤维细胞环氧合酶表达的影响［J］.现代口腔医学杂志，2010，24（5）：355-356.

［13］Herath TDK，Wang Y，Seneviratne CJ，et al. Porphy romonas gingivalis lipopolysaccharide lipid A heterogeneity differentially modulates the expression of IL-6 and IL-8 in human gingival fibroblasts［J］. J Clin Periodontol，2011，38（8）：694-701.

［14］Kishimoto T. IL-6：From its discovery to clinical applications［J］. International Immunology，2010，22（5）：347-352.

［15］魏丛丛，蒋少云，邓嘉胤.牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人牙龈成纤维细胞炎症刺激作用的研究［J］.天津医药，2013，41（5）：419-420.

Effect of lipopolysaccharide（LPS）on the expression of TNF-α and IL-6 in Human periodontal fibroblast cells

YUAN Xueming1LIU Lubin1ZHAO Zhixiang2
1.Department of 2nd Dental，the Stomatology Hospital of Second Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China；2.Jiamusi University，Jiamusi 154002，China

［Abstract］Objective To study the effect of lipopolysaccharide（LPS）on the expression of TNF-α and IL-6 in human periodontal fibroblast cells. Methods HPLFs cells were cultured. The cells were divided into LPS stimulated 0 mg/L （control group），1 mg/L（experimental groupⅠ）and 10 mg/L（experimental groupⅡ）. The expression of IL-6 and TNF-α was detected by ELISA method. Results The expression of LPS，TNF-α and IL-6 in HPLFs was significantly higher than that in control group at 6 hours，the expression of groupⅡand groupⅠwas significantly higher than that in control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）. The expression of I and TNF-in HPLFs was significantly higher than that in control group，the difference was statistically significant in the expression groupⅡand IL-6 in LPS in 12 hours（P＜0.01）. The expression of TNF-α and IL-6 in HPLFs cells with LPS stimulus concentration in a dosedependent manner；and the control group，and groupⅠ，groupⅡby LPS stimulation the expressions of 12 hours of TNF-α and IL-6 were significantly higher than those in the 6 h of stimulation，the difference was statistically significant（P＜0.01）. Conclusion Lipopolysaccharide（LPS）can stimulate the secretion of TNF-α and IL-6 inflammatory factors in human periodontal fibroblast cells.

［Key words］Lipopolysaccharide lipopolysaccharide（LPS）；Human periodontal fibroblast；TNF-α；IL-6

［中图分类号］R780.2

［文献标识码］B

［文章编号］1673-9701（2016）10-0001-03

收稿日期：（2016-01-08）