DHA激活NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路诱导ARPE-19细胞表达HO-1①

刘越峰　罗卫民　张　勇　钟晓东

(湖北医药学院附属十堰市太和医院眼科中心，十堰442000)



DHA激活NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路诱导ARPE-19细胞表达HO-1①

刘越峰罗卫民②张勇钟晓东

(湖北医药学院附属十堰市太和医院眼科中心，十堰442000)

[摘要]目的：观察二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)诱导人视网膜色素上皮细胞表达血红素氧合酶(Heme oxygenase，HO)-1的分子机制。方法：培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19，加入30～100 μmol/L DHA作用4～24 h。Western blot检测HO-1的表达及NADPH氧化酶p47phox亚基的磷酸化；荧光探针H2DCFDA检测活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生；免疫荧光分析Nrf2在细胞核及胞浆中的表达；最后采用NADPH氧化酶抑制剂DPI，ROS抑制剂NAC或采用siRNA干扰Nrf2表达，检测其对HO-1表达的影响。结果： 100 μmol/L DHA作用ARPE-19细胞30 min即可诱导p47phox亚基的磷酸化，同时能增加细胞内ROS的含量；采用NADPH氧化酶抑制剂DPI处理后，ROS水平显著降低；免疫荧光实验显示DHA作用细胞2 h后，可诱导Nrf2核转位，采用DPI或NAC处理后，Nrf2核转位水平明显减少；采用Nrf2 siRNA沉默其表达，或采用DPI或NAC处理后，可抑制DHA诱导ARPE-19细胞表达HO-1。结论：DHA可能通过NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路途径诱导视网膜色素上皮细胞表达HO-1，从而发挥对细胞的保护作用。

[关键词]二十二碳六烯酸；视网膜色素上皮细胞；血红素氧合酶-1

年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD)是一种以进行性视网膜黄斑部退行性病变为特征的眼底疾病，好发于45岁人群，并随年龄增长有关，是常见的不可逆性致盲眼病之一[1,2]。目前认为，AMD是一种与遗传以及环境因素相关的因素疾病[3]。近年来的观点认为，氧化应激是多种AMD危险因素致病机制中的重要组成部分。由于黄斑部解剖学与组织学的特殊性，视网膜色素上皮细胞对氧化应激非常敏感：持续暴露于光照之下所积累的光氧化效应，以及视网膜色素上皮细胞吞噬光感受器外节盘膜后，细胞内可产生大量活性氧类(Reactive oxygen species，ROS)。此外，随着年龄的增长，视网膜色素上皮细胞清除ROS的能力有所降低。在AMD发生的整个阶段，由于视网膜色素上皮细胞与光感受器之间存在营养代谢等多方面的相互作用，因而它是AMD病变的中心环节。因此针对视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤及保护的研究，对探讨其致病机理以及临床治疗具有重要意义。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA) 是一种不饱和脂肪酸，它对中枢神经系统以及视网膜光感受细胞的发育及其功能具有重要的作用。有研究发现，DHA可有效改善光损伤所致的视网膜氧化应激反应，并能上调内源性抗氧化蛋白的表达[4,5]。本研究旨在探讨DHA对人视网膜色素上皮细胞表达血红素氧合酶(Heme oxygenase，HO)-1的影响及分子机制，从而为其临床应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要实验试剂ARPE-19细胞购自美国ATCC。DMEM培养基、无内毒素胎牛血清购自美国Gibco；DHA、β-actin多克隆抗体、NADPH氧化酶抑制剂DPI、ROS抑制剂NAC以及荧光探针H2DCFDA为Sigma-Aldrich产品。p-p47phox以及鼠抗人total-p47phox购自Cell Signaling。抗HO-1多克隆抗体、Nrf2多克隆抗体和兔抗鼠二抗购自Santa Cruz。Nrf2 siRNA由广州RiboBio公司合成，siRNA转染试剂盒购自Qiagen。细胞蛋白提取试剂盒和Bradford蛋白浓度测定试剂为Pierce产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养与处理ARPE-19细胞用DMEM培养基(含10%胎牛血清L-谷氨酰胺和抗生素)，置于37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。待细胞生长至密度为80%时，消化、换液并接种至6孔板中，并改用含1%血清的DMEM培养基培养24 h。随后细胞加入不同浓度的DHA作用4～24 h，提取蛋白用于下一步研究。

1.2.2细胞蛋白提取与Western blotARPE-19细胞经DHA处理结束后，用4℃无菌PBS漂洗1次，加入含蛋白酶抑制剂的Cocktails裂解细胞。胞浆蛋白的提取按照Pierce公司试剂盒(NE-PER Nuclear & Cytoplasmic Extraction Reagents KIT)提供的操作步骤进行。采用Bradford法测定蛋白浓度。并获取20 μl蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后采用半干转印方法将其转印至硝酸纤维素膜上。纤维素膜用5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，随后分别用相应的一抗和二抗孵育，ECL显影、拍照。

1.2.3ROS测定ARPE-19细胞处理完毕后，加入分子探针染液H2DCFDA(终浓度5 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min。经PBS充分洗涤后，在荧光分光光度计(Infinite F200 Pro，TECAN)上设置激发波长485 nm，发射波长530 nm，测量细胞内的荧光强度(Fluorescence intensity)，并计算荧光的相对值，计算公式：处理组荧光强度/对照组荧光强度×100%(Relative intensity)。

1.2.4免疫荧光观察Nrf2核转位生长于盖玻片上的ARPE-19细胞处理完毕后，用3.5%多聚甲醛重悬浮细胞，室温固定15 min。经甲醇通透10 min并经无菌PBS洗涤后，滴加1%羊血清至盖玻片上室温封闭30 min。随后PBS洗涤3次，并加入抗Nrf2抗体室温孵育2 h。洗涤后继续加入C3标记羊抗鼠二抗孵育1 h。激光共聚焦显微镜拍照(Nikon C2 Plus)。

1.2.5细胞转染生长于培养皿中(约5×105)中的ARPE-19细胞更换为无血清培养基培养18～24 h。siRNA的转染按照Qiagen提供的步骤进行。即100 nmol/L Nrf2 siRNA或对照siRNA与转染试剂混合后，加至细胞培养液中。4 h后用无菌PBS漂洗细胞，并将无血清培养基更换为完全培养基，随后加入DHA孵育后用于下一步研究。

2结果

2.1DHA诱导ARPE-19细胞中NADPH氧化酶p47phox亚基磷酸化未经DHA处理的空白对照组细胞中p47phox磷酸化水平极低，当采用100 μmol/L DHA孵育10 min后，可明显上调细胞内磷酸化p47phox水平，随着时间的延长，磷酸化水平逐渐增多，1 h后达到峰值，而总p47phox含量保持不变(图1)。

图1　DHA诱导ARPE-19细胞p47phox亚基磷酸化Fig.1　DHA induces p47phox subunit phosphorylation in ARPE-19 cells

图2　DHA与DPI对ARPE-19细胞产生ROS的影响Fig.2　Effect of DHA and DPI on production of ROS in ARPE-19 cellsNote: *.P<0.05,as compared with control (0 μmol/L DHA);#.P<0.05,as compared with 0 μmol/L DHA.

图3　DPI、NAC对DHA诱导Nrf2核转位的影响Fig.3　Effect of DPI,NAC and DHA on nuclear translocation of Nrf2

2.2DHA经NADPH氧化酶诱导ROS产生30～100 μmol/L DHA处理ARPE-19细胞4 h后，可有效增加细胞内ROS的含量。而细胞在DHA处理前给予10 μmol/L DPI预处理1 h，结果显示ROS含量明显降低(图2)。

2.3DHA经ROS激活Nrf2ARPE-19细胞在DHA处理前，Nrf2位于细胞浆中。经100 μmol/L DHA处理4 h后，细胞核中Nrf2显著增多。而ARPE-19首先用10 μmol/L DPI或10 mmol/L NAC预处理1 h后，可显著抑制DHA诱导Nrf2核转位(图3)。

2.4DHA上调ARPE-19细胞中HO-1蛋白表达未刺激时，ARPE-19细胞内HO-1蛋白表达水平很低。采用30、50和100 μmol/L DHA刺激18 h后，HO-1蛋白表达水平随着DHA浓度的增高而递增(图4)。

图4　DHA上调ARPE-19细胞表达HO-1蛋白Fig.4　DHA induces HO-1 expression in ARPE-19 cells

图5　DPI、NAC或Nrf2 siRNA对DHA诱导HO-1表达的影响Fig.5　Effect of DPI,NAC and Nrf2 siRNA on DHA-induced HO-1 expressionNote: A.DPI and NAC on DHA induced HO-1 expression;B.Effect of Nrf2 siRNA on DHA-induced HO-1 expression.

2.5DHA诱导HO-1产生与NADPH氧化酶/ROS/Nrf2有关ARPE-19细胞在DHA处理前，HO-1表达量极低。经100 μmol/L DHA处理18 h后，细胞中HO-1表达显著增多。而ARPE-19首先用10 μmol/L DPI或10 mmol/L NAC预处理1 h后，可显著抑制DHA诱导HO-1表达。此外，采用siRNA干扰Nrf2表达后，HO-1表达水平也显著减少(图5)。

3讨论

AMD是与衰老密切相关的一种疾病，长期以来，氧自由基学说占有十分重要的地位。各种活性氧的产生所致的氧化应激反应，在多种年龄相关性疾病如白内障、Parkinson病、Alzheimer病中与AMD具有类似的病理生理特征。有研究表明，给予抗氧化制剂后，可有效改善视网膜色素上皮细胞功能，而这一过程与上调HO-1的表达有关。HO是降解血红素代谢为CO、Fe2+和胆绿素的限速酶。生理条件下，HO共有三种同工酶，即HO-1、HO-2和HO-3，其中仅HO-1为诱导型。多种病理生理状态，如氧化应激、感染、糖尿病和视网膜病变等因素均可上调其表达[6]。HO-1可通过其产物CO、胆红素和Fe2+而发挥细胞保护作用，包括降低TNF-α的促凋亡毒性[7]，维持血管内皮细胞的生理功能，减轻炎症和氧化应激损伤[8]。

研究表明，HO-1的表达受多种激酶和核转录因子的调控。NADPH氧化酶也称NOX，是由质膜结合成分和胞浆成分组成的一个多酶复合体，其中胞浆部分主要由p47phox、p67phox、p40phox、Rac2、Cdc42等组成。多种外源性因素可诱导p47phox磷酸化，后者随后由胞浆转位到质膜，从而组装成有具有完整功能的NADPH氧化酶。因此可通过检测p47phox的磷酸化水平间接判断NADPH氧化酶的激活[9]。随后NADPH 氧化酶可通过一系列电子传递催化ROS的生成，包括O2·、H2O2、HO·、NO·等。尽管ROS的过度产生可引起细胞大分子如蛋白质、DNA的氧化损伤，但适量的ROS也是细胞内的重要信号分子[10]。有研究显示，多种因素所致的HO-1表达与ROS有关[11]。本研究也发现，DHA处理后，可明显诱导ARPE-19细胞产生ROS。而采用NADPH氧化酶抑制剂DPI处理后，ROS产生显著降低。而同时采用ROS清除剂NAC处理后，HO-1表达显著减少，这表明HO-1的表达受NADPH氧化酶/ROS的调控。

Nrf2是一种重要的氧化应激转录保护因子。生理条件下Nrf2存在于胞浆中，并与胞浆中抑制蛋白Keap1相结合。当细胞受到各种外源性刺激时，Keap1经泛素化降解而促使其与Nrf2分离。Nrf2随后转移至细胞核内与基因 5′非编码区的抗氧化应激反应性元件(Antioxidant response element，ARE)相结合而启动相关基因的转录[12]。本研究也发现DHA处理后，Nrf2转移至细胞核内而调控HO-1的表达。此外，通过采用DPI或NAC处理后，Nrf2的核转位受到明显抑制，这表明Nrf2的激活与NADPH氧化酶/ROS有关。同时，采用Nrf2 siRNA沉默后发现，HO-1的表达显著减少，这表明HO-1的表达最终受ROS/Nrf2的调控。

总之，本研究证实DHA通过激活NADPH氧化酶/ROS信号通路，从而诱导HO-1的表达，HO-1可能通过多种机制发挥对氧化应激的细胞保护作用。但由于参与调控HO-1表达的激酶众多，如PI3K/Akt，蛋白激酶C等，这一切还有待进一步深入研究。

参考文献：

[1]French DD,Margo CE.Age-related macular degeneration,anti-vascular endothelial growth factor agents,and short-term mortality:a postmarketing medication safety and surveillance study[J].Retina,2011,31(6):1036-1042.

[2]Seddon JM,Reynolds R,Maller J,etal.Prediction model for prevalence and incidence of advanced age-related macular degeneration based on genetic,demographic,and environmental variables[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,50(5):2044-2053.

[3]Hemminki K,Forsti A,Li X,etal.Familial risks of age-related macular degeneration[J].Am J Ophthalmol,2011,151(3):561-562.

[4]Ramchani-Ben OK,Cercy C,Amri M,etal.Dietary supplement enriched in antioxidants and omega-3 protects from progressive light-induced retinal degeneration[J].PLoS One,2015,10(6):e0128395.

[5]Johansson I,Monsen VT,Pettersen K,etal.The marine n-3 PUFA DHA evokes cytoprotection against oxidative stress and protein misfolding by inducing autophagy and NFE2L2 in human retinal pigment epithelial cells[J].Autophagy,2015，11(9)：1636-1657.

[6]Paine A,Eiz-Vesper B,Blasczyk R,etal.Signaling to heme oxygenase-1 and its anti-inflammatory therapeutic potential[J].Biochem Pharmacol,2010,80(12):1895-1903.

[7]Morse D,Pischke SE,Zhou Z,etal.Suppression of inflammatory cytokine production by carbon monoxide involves the JNK pathway and AP-1[J].J Biol Chem,2003,278(39):36993-36998.

[8]Florczyk U,Jazwa A,Maleszewska M,etal.Nrf2 regulates angiogenesis:effect on endothelial cells,bone marrow-derived proangiogenic cells and hind limb ischemia[J].Antioxid Redox Signal,2013,20(11):1693-1708.

[9]Pick E.Role of the Rho GTPase Rac in the activation of the phagocyte NADPH oxidase:outsourcing a key task[J].Small GTPases,2014,5:e27952.

[10]Hawkes HJ,Karlenius TC,Tonissen KF.Regulation of the human thioredoxin gene promoter and its key substrates:a study of functional and putative regulatory elements[J].Biochim Biophys Acta,2014,1840(1):303-314.

[11]Cui G,Luk SC,Li RA,etal.Cytoprotection of baicalein against oxidative stress-induced cardiomyocytes injury through the Nrf2/Keap1 pathway[J].J Cardiovasc Pharmacol,2015,65(1):39-46.

[12]Vriend J,Reiter RJ.The Keap1-Nrf2-antioxidant response element pathway:a review of its regulation by melatonin and the proteasome[J].Mol Cell Endocrinol,2015,401:213-220.

[收稿2015-09-20修回2015-11-17]

(编辑倪鹏)

Docosahexaenoic acid induces retinal pigment epithelial cells expression of heme oxygenase-1 by activation of NADPH oxidase/ROS/Nrf2

LIUYue-Feng,LUOWei-Min,ZHANGYong,ZHONGXiao-Dong.

DepartmentofOphthalmology,TaiheHospitalofShiyanAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China

[Abstract]Objective:To observe the molecular mechanism of Docosahexaenoic acid (DHA) on the expression of heme oxygenase (HO-1) in human retinal pigment epithelium cells.Methods: Human retinal pigment epithelium cell line ARPE-19 was cultured in vitro and was treated with 30-100 μmol/L DHA for 4-24 h.Phosphorylation of NADPH oxidase p47phoxsubunit was detected by Western blot.Production of reactive oxygen species (ROS) was detected by fluorescent probe.Activation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) was detected by immunofluorescence.At last,DPI,an inhibitor of NADPH oxidase,NAC (ROS inhibitor),or Nrf2 siRNA was used to test their effect on HO-1 expression.Results: Treatment of ARPE-19 cells by 100 μmol/L DHA for 30 min could phosphorylate the p47phoxand increase the production of ROS.Preincubation of the NADPH oxidase inhibitor DPI significantly decrease the ROS level.Nuclear translocation of Nrf2 was also induced after DHA stimulation for 2 h,as demonstrated by immunofluorescence,DPI and NAC could inhibit the nuclear translocation of Nrf2.Transfection of Nrf2,or incubation of DPI and NAC could significantly abrogate DHA induced HO-1 expression.Conclusion: DHA protects retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via NADPH oxidase/ROS/Nrf2 pathway.

[Key words]Docosahexaenoic acid;Retinal pigment epithelial cells;Heme oxygenase-1

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.009

作者简介：刘越峰(1978年-)，女，硕士，主治医师，主要从事眼底疾病的基础与临床研究，E-mail：liuyuefeng828@126.com。通讯作者及指导教师：罗卫民(1978年-)，男，硕士，副主任医师，主要从事转化医学的基础与临床研究，E-mail：weiminluo120@163.com。

中图分类号R774.5

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0644-04

①本文受十堰市科学技术研究与开发项目计划(14Y40)资助。

②湖北医药学院附属十堰市太和医院心胸外科，十堰442000。