Smad4基因条件性敲除对T细胞发育的影响

丘桂华　张雪莹　曹焕玲　赵亚伟　张纪岩

(广西医科大学研究生学院，南宁530021)



Smad4基因条件性敲除对T细胞发育的影响

丘桂华张雪莹①曹焕玲②赵亚伟③张纪岩

(广西医科大学研究生学院，南宁530021)

[摘要]目的：探讨特异性地在T细胞中敲除Smad4基因后，对T细胞发育的影响。 方法：制备小鼠胸腺单细胞悬液，通过流式细胞术检测表面标记分子CD4、CD8、TCRβ、NK1.1、γδT CR和核因子Foxp3的表达情况。 结果：Smad4在T细胞中的缺失不影响CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4+ SP、CD8+ SP、TCRβhi、NK1.1+ TCRβ-、NK1.1+ TCRβ+、CD8-γδT +、CD8+γδT+、CD4+Foxp3+ nTreg等细胞亚群在胸腺细胞中的比例与绝对数。 结论：Smad4基因在T细胞中的条件性敲除不影响T细胞的发育。

[关键词]T细胞;Smad4;发育;小鼠

Smad家族蛋白是TGF-β/Smad信号通路将胞外信号传递至胞内的一个重要家族蛋白，Smad家族蛋白包括Smad1至Smad8[1]。Smad4蛋白是其中之一，Smad4和Smad2、Smad3组成的三聚体介导了TGF-β I类受体的信号传递[2]。因而可以看出，Smad4在TGF-β信号通路中发挥了重要的作用。在T细胞中，TGF-β信号通路对其免疫功能发挥和维持起了重要的作用，部分机制在于影响nTreg的发育[3]，然而目前关于Smad4蛋白缺失对T细胞发育影响的研究却很少。我们的研究主要的目的就是利用Smad4基因条件性缺失小鼠模型，探索Smad4对于T细胞发育的可能影响。鉴于Smad4完全敲除的小鼠由于外胚层形成的缺陷在胚胎早期就会死亡，我们引进了利用Cre-loxP系统的Smad4条件基因打靶小鼠(Smad4Co/Co)，与Lck近端启动子驱动的Cre重组酶转基因小鼠配种繁殖，获得Smad4基因T细胞条件性敲除的小鼠(Smad4Cre/Co/Co)，同窝同性别的Smad4Co/Co小鼠作为对照。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物本实验所使用的Smad4基因T细胞条件性敲除小鼠(Smad4Cre/Co/Co)和对照小鼠——Smad4条件基因打靶小鼠(Smad4Co/Co)均由军事医学科学院八所杨晓教授提供。小鼠饲养于军事医学科学院实验动物中心SPF清洁实验动物房。

1.1.2主要试剂动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购自北京百泰克生物技术有限公司；PCR反应混合体系Taq 2×Mix购自TIANGEN公司；引物合成由北京诺赛基因公司完成；DNA电泳上样缓冲液、DNA Marker (D2000 DNA Ladder) 购自北京索莱宝科技有限公司；透化液、固定液、各种荧光素标记的抗CD4、CD8等抗体以及同型抗体购自eBioscience公司；破红液、FACS洗液等为本实验室常规配制；Actin抗体购于北京中杉金桥公司；Smad4抗体购于Cell Signaling Technology公司；凝胶电泳及转印设备购于Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取基因组的提取说明参照试剂盒说明书。

1.2.2聚合酶链式反应(PCR)PCR引物由北京诺赛基因公司合成，引物序列见表1。

PCR反应条件：94℃，1 min；68℃，80 s；72℃，30 s；94℃，2 min；94℃，30 s；60℃，30 s；72℃,1 min；30 cycles；72℃，8 min；4℃，保存。

1.2.3Western分析取小鼠胸腺后研磨制成单细胞悬液，细胞计数，取106/样，RIPA裂解液冰上裂解15 min后，4℃ 13 000 r/min，15 min，取上清并调整蛋白浓度，最后加入4×loading buffer。煮沸10 min使其彻底变性。然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿转3 h至PVDF膜上，5%脱脂奶粉(TBST溶解)室温封闭1 h，相应条带加入对应的Smad4或者β-actin抗体，4℃过夜，山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室温孵育1 h。最后在膜上涂ECL显影及曝光。

1.2.4表面标记分子染色及分析①取小鼠胸腺后研磨制成单细胞悬液，细胞计数，取106/样，1 200 r/min 4 min；②取一定的FACS洗液(2% FBS，0.1% NaN3in PBS)重悬细胞，使染色的总体系为100 μl；③按照说明书要求每个样品加入一定量的荧光标记的表面标记分子抗体或同型对照抗体，完成后混合均匀；④4℃避光放置30 min；⑤1 200 r/min 4 min离心去上清，加入FACS洗液1 ml/样洗一遍，最后用200 μl的1%的多聚甲醛重悬后4℃放置或者立刻用流式细胞仪(Becton Dickinson FACSCalibu) 检测分析。

1.2.5Foxp3染色及分析在收集细胞后用eBioscience公司fixation/permeabilization 试剂盒进行破膜固定，然后加入PE标记的Foxp3抗体，4℃避光放置30 min染色，洗涤后4℃放置或者立刻用流式细胞仪检测分析。

2结果

2.1敲除小鼠的基因型鉴定在Smad4Cre/Co/Co小鼠体内如果Cre重组酶表达，将介导相同方向位于同一条染色体上的2个LoxP之间的基因重组，除去2个LoxP之间的外显子8序列，在染色体上只保留1个LoxP位点，用引物Smad4-7，Smad4-10进行扩增可扩增出包含一个LoxP位点和部分外显子9基因的234 bp的DNA片段。我们提取了鼠尾组织的基因组DNA，用特异性引物进行PCR的结果显示：在Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠中均可扩出被Flox锚定的片段；而只有Smad4Cre/Co/Co小鼠可以扩增出Lck-Cre片段，同时也能够扩增出被Cre酶敲除的234 bp DNA片段(图1)。因此在DNA水平上，可以认为我们引进的小鼠模型正确。

图1　Smad4Co/Co小鼠与Smad4Cre/Co/Co小鼠基因型鉴定Fig.1　Phenotype analysis of Smad4Co/Co mice and Smad4Cre/Co/Co mice

表1引物序列

Tab.1Primer sequence

GenotypePrimersequenceLengthLck-Cre5'-TGGGAGGCAGGAAGTGGGTAACTAGACTAA-3'420bp5'-GAAGATAATCGCGAACATCTTCAGG-3'AnchorbyfloxSmad4-95'-GGGCAGCGTAGCATATAAGA-3'WildtypeSmad4gene385bp;anchorbyloxPSmad4gene438bpSmad4-105'-GACCCAAACGTCACCTTCAC-3'DeletebyCreenzymeSmad4-75'-CCTTAGTTGAAGCTTATAACTTCG-3'Exon8ofSmad4gene,234bpSmad4-105'-GACCCAAACGTCACCTTCAC-3'

2.2敲除小鼠的Western鉴定Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺细胞Western分析显示，在Smad4Co/Co小鼠的胸腺细胞中能够检测到Smad4蛋白表达，而在Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺细胞中，Smad4蛋白不表达(图2)。所以在蛋白水平上，可以认为我们引进的小鼠模型正确。

2.3Smad4缺失对T细胞发育的影响Lck近端启动子在T细胞发育的早期即双阴性阶段即开始发挥作用[4]，于是我们首先分析的Smad4缺失是否影响γδT细胞发育经历双阴性阶段、双阳性阶段和单阳性阶段、TCRβ表达增强、nTreg生成的过程。为了防止继发的炎症反应对T细胞发育的可能影响，我们利用7天大新生小鼠进行了分析，在这个时间点，胸腺内T细胞发育均已完成并且已经生成nTreg[5]。我们对胸腺细胞进行了CD4/CD8和CD4/Foxp3染色分析，发现Smad4缺失不影响CD4-CD8-DN(Co/Co:8.4%±1.5% vs Cre/Co/Co：9.5%±1.7%)、CD4+CD8+DP (Co/Co：76.9%±5.7% vs Cre/Co/Co：73.6%±5.7%)、CD4+SP(Co/Co:9.2%±3.6% vs Cre/Co/Co：10.3%±4.7%)、CD8+SP(Co/Co：5.5%±1.4% vs Cre/Co/Co：6.6%±0.9%)和CD4+Foxp3+ nTreg(Co/Co：0.36%±0.06% vs Cre/Co/Co：0.4%±0.07%)亚群的比例。T检验结果显示，以上细胞亚群比例在统计学上没有差异(图3A、B)。我们还计算了上述细胞亚群的绝对数，发现Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠中上述细胞亚群的绝对数也没有统计学差异(图4A、B)。

图2　Western分析小鼠胸腺细胞中Smad4蛋白表达水平Fig.2　Western analysis of Smad4 expression in thymocytes

图3　 Smad4Co/Co与Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺各亚群细胞的比例(n=6)Fig.3　Subset percentages of Smad4Co/Co and Smad-4Cre/Co/Co thymocytes(n=6)Note: A.Representative data of CD4 and CD8 staining;B.Representa-tive data of CD4 and FoxP3 staining;C.Representative data of γδT CR and CD8 staining;D.Representative data of NK1.1 and TCRβ staining.

2.4Smad4缺失对其他在胸腺内发育的淋巴细胞亚群的影响除了γδT细胞，部分γδT 细胞、NKT细胞和少量NK细胞的发育也在胸腺中完成，并且其发育的时间点在双阴性阶段之后[6-8]。因此，我们还对胸腺细胞进行了NK1.1/ TCRβ、CD8/γδT CR染色分析，发现Smad4缺失不影响CD8-γδT+(Co/Co:0.6%±0.05% vs Cre/Co/Co:0.6%±0.02%)、CD8+γδT+(Co/Co:0.57%±0.25% vs Cre/Co/Co:0.55%±0.08%)、NK1.1+TCRβ-(Co/Co:1.6%±0.02% vs Cre/Co/Co:1.4%±0.3%)、NK1.1+TCRβ+(Co/Co:0.57%±0.028% vs Cre/Co/Co:0.41%±0.16%)亚群的比例。T检验结果显示，以上细胞亚群比例在统计学上没有差异(图3C、D)。 我们还计算了上述细胞亚群的绝对数， 发现Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠中上述细胞亚群的绝对数也没有统计学差异(图4C、D)。

图4　Smad4Co/Co与 Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺各亚群细胞的绝对数(n=6)Fig.4　Total number of thymocytes subsets in Smad4Co/Co and Smad4Cre/Co/Co mice respectively(n=6)Note: A.Total number of CD4+ SP,DP,DN,CD8+ SP thymocytes and its P value；B.Total number of CD4+FoxP3+ (nTreg) thymocytes and its P value.C.Total number of γδT+CD8- and γδT+CD8+ thymocytes and its P value.D.Total number of NK1.1+ TCRβ- and NK1.1+TCRβ+ thymocytes and its P value.

3讨论

Smad4是TGF-β信号转导通路中的一个重要分子，Smad4和Smad2、Smad3共同介导TGF-β I类受体的信号传递。研究表明TGF-β在细胞分化、增殖、免疫抑制等诸多方面发挥了重要作用[3,9,10]。TGF-β能够通过促进Foxp3的表达从而促进Treg的发育[3]。Smad4与TGF-β信号通路的关系密切，我们推测Smad4蛋白可能在这些免疫细胞的发育成熟过程也起着同样的作用。通过对一系列的表面分子的流式分析，结果发现Smad4在T细胞中的条件性缺失对CD4、CD8和Treg细胞的发育并无显著影响，并且也不影响其他在胸腺中发育的淋巴细胞亚群。我们的结果说明，TGF-β对T细胞的发育的影响不依赖于Smad信号转导途径。

有研究者发现[11]，TGF-β介导T细胞的功能并不完全依赖于Smad家族蛋白，也存在着独立于Smad蛋白的途径，这些途径包括MAPKs，Rho-like GTPases或PI3K[12]。我们以前的发现提示MAPKs家族成员可能对Foxp3表达有重要影响[13]，可能MAPKs途径通过JNK或ERK对Foxp3表达产生影响，进而影响Treg细胞的发育。除此之外，研究发现[14,15]，降低活性的Akt促进了Treg细胞的发育，过表达的Akt抑制了Treg的发育，因而，Treg细胞的发育不是通过PI3K信号途径。那么会是通过Rho-like GTPases的途径吗？目前并没有关于这方面的报道，所以暂时无法判断这一通路在TGF-β诱导Foxp3表达中的作用。

4致谢

感谢军事医学科学院生物工程研究所杨晓研究员和兰雨研究员提供的小鼠，同时感谢本实验室其他同事给予的帮助与指导。

参考文献：

[1]Zhang YE，Rik D.Smad-dependent and smad-independent pathway in TGF-beta family signaling[J].Nature,2003:577-584.

[2]Derynck RJ,Balmain A.TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression[J].Nat Genet,2001,29(2):117-129.

[3]Li MO.Transforming growth factor-beta regulation of immune responses[J].Annu Rev Immunol,2006:99-146.

[4]Shimizu C,Kawamoto H,Yamashita M,etal.Progression of T cell lineage restriction in the earliest subpopulation of murine adult thymus visualized by the expression of lck proximal promoter activity[J].Int Immunol,2001,13(1):105-117.

[5]Luo CT,Li MO.Transcriptional control of regulatory T cell development and function[J].Trends Immunol,2013,34(11):531-539.

[6]Xiong N,Raulet DH.Development and selection of gammadelta T cells[J].Immunol Rev,2007:15-31.

[7]Sojka KD.Tissue-resident natural killer(NK)cells are cell lineages distinct from thymic and conventional splenic NK cells[J].Elife，2014:e01659.

[8]Bendelac AB,Teyton L.The biology of NKT cells[J].Biomed J,2007，25:297-336.

[9]Marie JC,Rudensky AY.Cellular mechanisms of fatal early-onset autoimmunity in mice with the T cell-specific targeting of transfor ming growth factor-beta receptor[J].Immunity,2006,25(3):441-454.

[10]Gorelik L,Flavell RA.Transfor ming growth factor-beta in T-cell biology[J].Nat Rev Immunol,2002,2(1):46-53.

[11]Gu AD,Wang Y,Lin L,etal.Requirements of transcription factor Smad-dependent and -independent TGF-β signaling to control discrete T-cell functions[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(3):905-910.

[12]Hu Y,Lee YT,Kaech SM,etal.Smad4 promotes differentiation of effector and circulating memory CD8 T cells but is dispensable for tissue-resident memory CD8 T cells[J].J Immunol,2015,194(5):2407-2414.

[13]Cao J,Zhang X,Wang Q,etal.Cyclic AMP suppresses TGF-β-mediated adaptive Tregs differentiation through inhibiting the activation of ERK and JNK[J].Cell Immunol,2013,285(1/2):42-48.

[14]Patton DT,Garden OA,Pearce WP,etal.Cutting edge:the phosphoinositide 3-kinase p110 delta is critical for the function of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells[J].J Immunol,2006,177(10):6598-6602.

[15]Liu G,Burns S,Huang G,etal.The receptor S1P1 overrides regulatory T cell-mediated immune suppression through Akt-mTOR[J].Nat Immunol,2009,10(7):769-777.

[收稿2015-09-25修回2015-11-17]

(编辑许四平)

Effects of conditional deletion ofSmad4 gene on T cell development

QIUGui-Hua,ZHANGXue-Ying,CAOHuan-Ling,ZHAOYa-Wei,ZHANGJi-Yan.

GuanxiMedicalVniversityGraduateSchool，Nanning530021，China

[Abstract]Objective:To study the role of Smad4 in T cell development.Methods: Single cell suspension of thymus was prepared and the expression of CD4，CD8，TCRβ，NK1.1，γδT CR and nuclear factor Foxp3 was examined by flow cytometry.Results: The percentages and absolute numbers of CD4-CD8-，CD4+CD8+，CD4+ SP，CD8+ SP，TCRβhi，NK1.1+TCRβ-，NK1.1+TCRβ+，CD8-γδT+，CD8+γδT+ CD4+Foxp3+ nTreg subsets remained unchanged in the absence of Smad4.Conclusion: Conditional deletion of the Smad4 gene does not affect T cell development.

[Key words]T cells;Smad4;Development;Mice

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.008

作者简介：丘桂华(1989年-)，男，在读硕士，主要从事免疫炎症信号转导方向的研究，E-mail:ghqiu09@163.com。通讯作者及指导教师：张纪岩(1972年-)，女，博士，研究员，主要从事免疫炎症信号转导方向的研究，E-mail:jiyanzhang@hotmail.com。

中图分类号R392.1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0640-04

①军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室，北京100850。

②河南大学研究生学院，郑州475001。

③河南省漯河市中心医院风湿科，漯河462000。