hVEGF基因修饰的SD大鼠BMSCs与胶原膜BME-10X复合物的成骨能力研究

江　燕，朱小峰，闫福华

1.福建医科大学 附属第一医院口腔科，福州　350005；



hVEGF基因修饰的SD大鼠BMSCs与胶原膜BME-10X复合物的成骨能力研究

江燕1，朱小峰1，闫福华2

1.福建医科大学 附属第一医院口腔科，福州350005；

摘要:目的观察人血管内皮生长因子(hVEGF165)基因的骨髓基质细胞(BMSCs)与胶原膜BME-10X复合的相容性及该复合物移植在体内的成骨情况，为其能否修复牙周骨质缺损提供依据。 方法在体外将hVEGF165基因转染的SD大鼠BMSCs种植于胶原膜BME-10X复合膜上，使用激光共聚焦扫描显微镜、荧光显微镜、扫描电镜及组织学方法进行观察，并将该复合物植入裸鼠皮下，于4、8周处死裸鼠取材制成组织切片，H-E染色后观察异位体内成骨和血管生成的情况。结果复合物培养24 h后见目的细胞在胶原膜中贴附、伸展，各层BME-10X胶原膜上均有数量不等的细胞附着。转染细胞在胶原膜表面复层生长，并进入内部间隙中。复合物植入裸鼠皮下后，可见新生胶原纤维、类骨质样结构和新生血管的形成。结论hVEGF165基因转染BMSCs在胶原膜BME-10X上生长良好，细胞-胶原复合物在裸鼠体内具有异位成骨及促进新生血管形成能力。

关键词:人血管内皮细胞； 骨髓基质干细胞； 基因治疗； 组织工程； 牙周组织再生； 胶原膜

牙周病所导致的牙周支持组织的破坏已成为门诊拔牙的主要原因，而如何重建牙周新附着、恢复牙槽骨高度，进而根治牙周病是临床急需解决的问题。近年来，国内外的学者对骨形成蛋白-7(bone morphogenetic proteins-7，BMP-7)、血小板衍生因子-B(platelet-7 derived growth factor subunit B，PDGF-B)、碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor， b-FGF)作为目的基因构建组织工程复合物修复牙周组织缺损进行了一系列的研究，证明基因工程与组织工程的联合应用为牙周骨质重建提供了一个行之有效的方法[1-4]。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是组织工程中理想的种子细胞，人血管内皮生长因子(human vascularendothelial growth factor 165，hVEGF165)有强大的血管生成和骨再生作用[5]，并可以促进体外培养的BMSCs的增殖和分化[6]。本研究以hVEGF165基因转染SD大鼠BMSCs，将其种植于胶原膜BME-10X上构建基因强化的组织工程复合物[7]，观察两者的相容性，进而在动物实验模型(裸鼠)体内观察该复合物的异位成骨能力，为下一步将该复合物植入人体重建缺损的牙周组织提供实验基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物雄性清洁级SD大鼠12只，体质量(130±20)g；6周龄BALB/c雄性裸鼠14只，均购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.1.2仪器与试剂DMEM培养基(美国Gibco公司)；医用组织引导再生胶原膜BME-10X(福建省博特生物科技有限公司)；荧光倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；激光共聚焦扫描显微镜(德国Leica公司)；场发射扫描电镜(美国FEI Nova Nano公司)。

1.2方法

1.2.1hVEGF165基因转染BMSCs的获得采用全骨髓法培养SD大鼠BMSCs，取培养第3代的干细胞进行实验[8]。用携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)标志hVEGF165基因重组腺病毒载体(Ad5-hVEGF165-EGFP)转染SD大鼠BMSCs(形成的细胞简称为hVEGF165-BMSCs)[9]，MOI为100。

1.2.2hVEGF165-BMSCs与胶原膜BME-10X的复合将BEM-10X膜剪成4 mm×4 mm大小，充分吸收培养液DMED后放置于24孔板中，在每张膜中放入1×105个hVEGF165转染的BMSCs，培养24 h，分别取等量复合体进行相关处理后用荧光倒置相差显微镜、激光共聚焦扫描显微镜及场发射扫描电镜进行观察，剩余复合体培养3 d后制备成石蜡切片，H-E染色后用生物显微镜进行组织学观察。

1.2.3基因修饰的SD大鼠BMSCs与胶原膜BME-10X复合物体内异位成骨实验裸鼠14只随机分为4组：A组：空白膜组；B组：BMSCs+胶原膜组；C组：空载体转染BMSCs+胶原膜组；D组：hVEGF165转染BMSCs+胶原膜组。每组3只，另外2只备用。参照文献[10]的方法将复合物植入大鼠体内，于4，8周处死裸鼠，取背部标本，组织学切片观察。

2结果

2.1基因修饰的SD大鼠BMSCs与胶原膜BME-10X复合情况的体外观察

2.1.1复合物培养24 h的观察

2.1.1.1倒置相差荧光显微镜观察目的细胞发出绿色荧光，接种2 h后可在胶原膜上见部分圆形贴壁细胞，24 h细胞部分伸展开，并在膜边缘呈纤维样(图1A)。

2.1.1.2激光共聚焦显微镜观察各层BME-10X胶原膜均可见数量不等的发出绿色荧光的细胞附着(图1B)。

2.1.1.3扫描电镜观察BME-10X胶原膜表面可见粗细不等的胶原纤维，内部有大小不一的孔隙，表面及内部均可见细胞生长，部分呈多角形。(图1C)。

2.1.2复合物培养3 d的组织学观察胶原膜表面细胞呈层状生长，内部孔隙中也有部分细胞长入(图1D)。

2.2hVEGF165基因修饰的BMSCs与胶原膜BME-10X复合物裸鼠体内异位成骨

2.2.1大体观察所有裸鼠术后伤口愈合良好，植入物所在部位无免疫排斥反应，存活至实验结束。分别于植入4，8周后处死裸鼠：植入4周后各组植入物基本没有吸收，表面纤维组织包绕，与皮下组织粘连；植入8周后胶原膜厚度有所减少，融合良好，可见B、C及D组标本有不同程度的降解吸收。

2.2.2组织学观察

2.2.2.1植入4周后的组织学观察A组胶原膜基本无降解，边界清晰并被纤维组织包绕，材料内部有少量散在的细胞和片状新生胶原；B、C和D组可见胶原膜边缘部分纤维溶解伴断裂，出现降解吸收，整体体积变小，膜的两侧及中间出现大量长圆形或梭形细胞、块状的新生胶原组织及不规则条索状未成熟的类骨样基质；D组还可见少量新生血管形成，管腔中可见红细胞(图2，箭头处为血管)。

2.2.2.2植入8周后的组织学观察A组胶原膜内可见大量裸鼠自体细胞，部分区域可见神经、肌肉及脂肪样组织；B、C和D组的胶原膜两侧被降解吸收，原本的条索状胶原支架明显变薄、消失，逐渐被较多新生的胶原、呈网状红染的骨基质、少量编织骨骨小梁及被覆其上的细胞所取代；D组还可见较多新生血管形成，管腔中可见红细胞(图3，箭头处为血管)。

3讨论

组织工程学自被提出后就引起了全世界各领域专家学者的广泛关注，也日益广泛地应用于口腔医学领域，特别是用于牙周组织的再生[11]。将体外培养的种子细胞种植于支架材料上，然后移植于牙周缺损区，细胞不断增殖并分泌基质的同时支架材料逐步降解，最终形成新的有功能活性的组织，从而有效促进了牙周组织缺损再生[12]。

除了种子细胞外，合适的支架材料也是构建组织工程复合物的关键。理想的组织工程支架材料应具备：良好的生物相容性、可吸收性、可塑性，表面微结构利于细胞粘附生长，降解速度与细胞生长速度相适应等特性。本实验所用的支架材料为胶原膜BME-10X，为可吸收医用组织引导再生胶原膜，主要成分为牛Ⅰ型胶原。笔者在早期研究中发现，该胶原膜不仅能维持骨髓基质细胞的生长与增殖，而且能与转染有目的基因BMP-7的BMSCs复合，同时人牙周膜成纤维细胞也可在该胶原膜上贴附、增殖，分泌大量的细胞外基质，形成具有活性细胞及其基质的膜样组织，进而促进牙周组织再生[2,7,10,13]。在本研究中也观察到：细胞-膜复合物培养24 h后，转染hVEGF165后的SD大鼠BMSCs生长于胶原膜的表面与内部；3 d后目的细胞在胶原膜表面呈复层生长的同时也能进入膜内部孔隙中。由此可见，BME-10X胶原膜的生物相容性良好，可以为转染hVEGF165的BMSCs提供一个安全的细胞粘附的微环境。

近年来，组织工程技术已广泛应用于牙周组织的再生研究[2-4,14]。牙周组织结构复杂，包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质，其再生的最终目标是形成牙周新附着。口腔微环境的特性决定了牙周再生过程不可能在绝对无菌的环境中进行，故血管化的组织工程物已经渐渐成为医学界关注的焦点[13]，为牙周再生提供了新的思路。建立一套完整的血管网，不仅能使组织工程复合物获得周围毛细血管网的营养支持，而且能使其内部的细胞和基质间有良好的信号传递，具有更强的抗感染能力，进行正常的新陈代谢，最终形成具有正常结构和功能的组织。因此，血管化的组织工程复合物在口腔这一有菌的环境下能更好地重建牙周组织。刘伯龄等的研究表明，转染hVEGF165基因的BMSCs能分泌有活性的VEGF蛋白[15]，而VEGF能提高成骨细胞活性，增强其迁移、增殖、分化并加速其骨形成[16-17]，并具有抗成骨细胞凋亡，维系成骨细胞的存活的作用[13]，而成骨细胞所分泌的碱性磷酸酶又显著提高了BMSCs的成骨活性。在本实验中，笔者发现复合物植入4周时，hVEGF165转染BMSCs+胶原膜组复合物的体内成骨能力与单纯细胞-膜复合物及空载体-膜复合物的相似，但hVEGF165转染BMSCs+胶原膜组还可见少量新生血管；但在植入8周后，转染hVEGF165的细胞-膜复合物中可见较多新生的胶原、相对成熟的骨质样组织及较多的新生血管形成，这与王伯龄等的研究相符合[15]。因此，笔者认为，BMSCs被hVEGF165转染后进行了一系列的正循环级联反应，这一反应不仅有效地促进了血管形成，也进一步增加了新骨生成。hVEGF165转染的BMSCs与胶原膜BME-10X复合后可以形成血管化的组织工程骨组织，通过基因转移技术可克服重组生长因子局部直接使用所带来半衰期短、引起免疫反应和毒性等的一系列问题，为下一步牙周组织再生的体内实验提供了理论依据。

综上所述，笔者认为，胶原膜BME-10X具有良好的生物相容性，转染hVEGF165后的SD大鼠BMSCs能在其中生长。体外合成的复合物在裸鼠体内具有异位成骨能力和良好的血管生成能力。但转染hVEGF165的BMSCs与胶原膜细胞及支架材料的相互作用机制及影响因素，以及上述复合物植入人体后能否最终促进牙周组织的再生，尚有待进一步的研究证实。

参考文献：

[1]Jin Q M,Anusaksathien O,Webb S A,etal. Gene therapy of bone morphogenetic protein for periodontal tissue engineering[J].JPeriodontol, 2003,74(2):202-213.

[2]李艳芬. hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的实验研究[D].福州：福建医科大学,2008.

[3]陈欣戬. hbFGF基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的实验研究[D].福州：福建医科大学,2009.

[4]钟泉. hPDGF-B基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的实验研究[D].福州：福建医科大学,2009.

[5]Wernike E,Montjovent M O,Liu Y,etal. VEGF incorporated into calcium phosphate ceramics promotes vascularisation and bone formationinvivo[J].EurCellMater,2010,19:30-40.

[6]Zhang G,Zhou J,Fan Q,etal. Arterial-venous endothelial cell fate is related to vascular endothelial growth factor and Notch status during human bone mesenchymal stem cell differentiation[J].FEBSLett, 2008,582(19):2957-2964.

[7]闫福华,周广东. 骨髓基质细胞在三种可吸收生物膜上附着及增殖的比较[J]. 福建医科大学学报, 2002,36(1):10-12.

[8]卢新政,张晓文,黄峻,等. 大鼠骨髓基质细胞培养方法的改良[J]. 中国心血管杂志,2004,1(1):48-51.

[9]江燕, 朱小峰, 邱宇, 等. 重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定[J]. 航天航空医学杂志,2014，(7):896-898.

[10]赵欣. 不同浓度骨髓基质细胞对牙周组织再生影响的实验研究[D].福州：福建医科大学,2009.

[11]Poll B,Buttler P,Graber H G,etal. Engrafting periodontal fibroblasts with new 3-dimensional polylactide foams[J].IntJArtifOrgans,2005,28(8):827-833.

[12]Chen F M,Jin Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities[J].TissueEngPartBRev,2010,16(2):219-255.

[13]Street J,Bao M,de Guzman L,etal. Vascular endothelial growth factor stimulates bone repair by promoting angiogenesis and bone turnover[J].ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(15):9656-9661.

[14]林泓兵,赵斌,丁子清,等. 生物活性复合膜对大鼠牙周组织缺损的修复作用[J]. 吉林大学学报:医学版, 2013,39(5):888-892,1090.

[15]刘伯龄, 张锡庆. hVEGF165基因转染后骨髓间充质干细胞蛋白分泌功能及成骨活性的检测[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2007,11(46):9242-9245.

[16]Mayer H,Bertram H,Lindenmaier W,etal. Vascular endothelial growth factor (VEGF-A) expression in human mesenchymal stem cells: autocrine and paracrine role on osteoblastic and endothelial differentiation[J].JCellBiochem, 2005,95(4):827-839.

[17]Geiger F,Bertram H,Berger I,etal. Vascular endothelial growth factor gene-activated matrix (VEGF165-GAM) enhances osteogenesis and angiogenesis in large segmental bone defects[J].JBoneandMineralResearch,2005,20(11):2028-2035.

(编辑:张慧茹)

The Complex Constructed by hVEGF165Genes Transfected BMSCs and Collagen Membrane (BME-10X) Enhanced Osteogenesis and Angiogenesis

JIANG Yan1， ZHU Xiaofeng1， YAN Fuhua2

1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The First Affiliated Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China;2.Institute and Hospital of Stomatology, Nanjing University School of Medicine, Nanjing 210008, China

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the possibility of forming new bones in rats by incorporating the hVEGF165transfected BMSCs with collagen membrane (BME-10X) to form a tissue-engineered cell and matrix complex, and transplanting it into Sprague Dawley rats.MethodsThe hVEGF165transfected BMSCs were cultured in BME-10X collagen matrix for 3 days.Histological examination was performed with light microscopy and H-E staining.Cell attachment was analyzed by fluorescence microscope, confocal laser scanning microscope, and scanning electron microscope.The gene-modified tissue-engineered complex, which was constructed by transfected BMSCs and BME-10X, was implanted into subcutaneous sites in nude mice.After 4 and 8 weeks, the animals were sacrificed and the tissue-engineered complex was evaluated by histology.ResultsWhen the transfected cells were seeded in BME-10X, it was noted that cell adhered and stretched well after 24 h of culture.Investigation under tomographic scanning with confocal laser scanning confocal microscope showed that cell and material integrated well.The study in vivo showed that when BMSCs were transplanted in the subcutaneous sites of nude mice, the transfected BMSC complex formed more contents of ossification and angiogenesis than those in the un-transfected group.ConclusionIn this study the BME-10X showed a good biocompatibility with hVEGF165transfected BMSCs.BMSCs transfected with VEGF165gene showed enhanced osteogenesis and angiogenesis both in vitro and in vivo.

KEY WORDS:vascular endothelial growth factor (hVEGF)； bone marrow stromal cells; gene therapy； tissue engineering； periodontal regeneration； collagen membrane

收稿日期:2015-09-15

基金项目:福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目(2013-ZQN-JC-22)；福建医科大学横向科研课题(2013B003)

作者简介:江燕(1986-)，女，医师，医学硕士通讯作者: 朱小峰. Email: dentzxf@163.com

中图分类号:R322.41； R329-33； R394.2； R783.1

文献标志码:A

文章编号:1672-4194(2016)01-0011-04

2.南京大学 口腔医学院，南京210008