可溶性klotho在系统性红斑狼疮中的变化及意义

林书典,詹　锋,潘楚瑛,张　延,刘　颖,詹宇威

(海南省人民医院肾病风湿科，海口 570311)

可溶性klotho在系统性红斑狼疮中的变化及意义

林书典,詹锋△,潘楚瑛,张延,刘颖,詹宇威

(海南省人民医院肾病风湿科，海口 570311)

[摘要]目的初步研究可溶性klotho(s-kl)在系统性红斑狼疮(SLE)和狼疮性肾炎(LN)中的变化及其意义。方法收集34例首诊首治SLE患者，根据是否合并LN分为SLE不合并LN组(SLE组，19例)和合并LN组(LN组，15例)，将17例常规体检者列为对照组。常规检测24 h尿蛋白定量(24 h Upro)、血常规、血生化指标和双链DNA(dsDNA)。采用ELISA法检测s-kl、25羟基维生素D(25-OH-D)和成纤维细胞生长因子-23(FGF-23)。对SLE组和LN组患者进行SLE疾病活动度评分(SLEDAI)，根据Cockcroft-Gault公式计算内生肌酐清除率(CCr)。比较3组间差异并对相关指标进行相关性分析。结果在SLE组和LN组中平均动脉压、血常规、酶学[肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)]、补体(补体C3和补体C4)及dsDNA与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组及SLE组比较，LN组24 h Upro、血脂[总胆固醇(CHOL)，三酰甘油(TG)]和血肌酐(SCr)显著升高，而血清清蛋白(ALB)和CCr明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。 SLE组与对照组s-kl、25-OH-D和FGF-23比较差异无统计学意义(P>0.05)；而在LN组中s-kl、25-OH-D及FGF-23血清水平与对照组和SLE组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。LN组患者SLEDAI评分较SLE组评分高(P<0.05)。相关分析表明，s-kl与25-OH-D、C3及C4存在正相关关系，与FGF-23、SLEDAI和dsDNA存在负相关关系(均P<0.05)。回归分析提示，s-kl、25-OH-D和FGF-23与SLE活动度无明显关系。结论SLE和LN患者体内s-kl水平的降低，可能是引起FGF-23升高的关键因素之一，由此进一步导致SLE和LN患者维生素D(VitD)缺乏和病情活动。

[关键词]klotho；红斑性狼疮，系统性；肾炎；维生素D

klotho是一新发现的抗衰老基因，主要表达于大脑脉络膜和肾脏组织中，其生物学影响可达全身各器官脏器。klotho基因缺失或表达低下可出现诸多临床表现，如动脉硬化、骨质疏松、氧化应激、肺气肿、早衰、不孕不育、免疫功能异常、内分泌功能失调据和生长发育迟缓等。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是导致全身多系统脏器损害的自身免疫性疾病，其临床表现与kloth基因缺失表型相似，尤其肾脏是其损害的重要器官。研究已证实，血液中可溶性klotho(soluble klotho，s-kl)主要来源于正常的肾脏组织，随着肾脏损伤加重和功能衰竭，其表达的s-kl基因及产物逐渐减少[1-2]，这提示s-kl基因表达状况及其生物学功能特征与狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)的发生发展密切相关，提示s-kl可能参与了LN的发生发展。本研究通过检测普通体检者及SLE和LN患者体内s-kl的变化，初步探讨s-kl在SLE及LN中的意义。

1资料与方法

1.1一般资料本研究入选病例为自2013年1月至2014年12月在本院肾病风湿科住院的首诊首治SLE患者，所有患者均符合1997年ACR SLE分类标准和(或)LN诊断标准[3]，共51例，其中17例因合并其他疾病，如类风湿关节炎、皮肌炎、慢性病毒性肝炎等，被剔除，其余34例为未合并其他疾病的单纯SLE患者纳入研究，并进行SLE疾病活动指数(SLEDAI)评分。根据是否合并LN分为SLE不合并LN组(SLE组，19例)和合并LN组(LN组，15例)。选择同时期年龄性别匹配，在本院体检中心进行常规体检者17例为对照组，对照组纳入标准为常规体检未发现高血压、肾脏疾病和骨骼疾病及其他脏器疾病(如心、肺、脑、肝脏等)，无常见风湿免疫病症状和体征，血糖、酶学、肝肾功能、心肌酶、类风湿因子、C反应蛋白(CRP)、补体及抗核抗体(ANA)和双链DNA(dsDNA)等基本正常者。所有入选对象自本研究开始前4周内均未服用激素和免疫抑制剂及影响钙磷代谢的药物。本研究获得本院医学伦理委员会批准，参与本研究对象均知情同意。

1.2方法

1.2.1常规血清学指标检测纳入本研究者，留取24 h尿液采用双缩脲法检测24 h尿蛋白定量(24 h Upro)。清晨空腹采静脉血(2×10 mL)，提取血清置-80 ℃低温冰箱中保存备检测。血常规采用全自动血液细胞学分析仪检测，全自动生化分析仪检测肝肾功能、血脂、血糖、酶学、补体、类风湿因子及CPR等。根据Cockcroft-Gault公式计算内生肌酐清除率(CCr)。ANA和dsDNA分别采用间接荧光免疫法和ELISA法，试剂盒为欧蒙医学实验诊断股份公司。

1.2.2s-kl、25-OH-D及FGF-23检测血清中s-kl(Immuno-Biological Laboratories公司，日本)、25羟基维生素D(25-hydroxy vitamin D，25-OH-D,北京荣志海达生物科技有限公司)，成纤维细胞生长因子-23(fibroblast growth factor，FGF-23,上海基免生物技术有限公司)的检测，均采用ELISA法检测，按照产品试剂盒说明书操作。

2结果

2.1纳入研究者临床基本资料比较所有纳入本研究的51名研究对象，按照研究设计分为对照组(17例)、SLE组(19例)和LN组(15例)。3组在年龄、性别比、体质量、肝功能和血糖方面的差异无统计学意义(P>0.05)。在SLE组和LN组中MAP、血常规(WBC、Hb和PLT)、酶学(CK和LDH)、补体(C3和C4)及dsDNA与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组和SLE组比较，LN组中24 h Upro、血脂(CHOL和TG)和SCr均有显著升高，而ALB和CCr下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　3组患者临床基本资料比较±s)

MAP:平均动脉压；WBC：白细胞；Hb：血红蛋白；PLT：血小板；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天门冬氨酶氨基转移酶；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脱氢酶；SCr：血清肌酐；CHOL：总胆固醇；TG：三酰甘油；a：P<0.05,与对照组比较;b：P<0.05,与SLE组比较；-：此项无数据。

2.2各组s-kl、25-OH-D、FGF-23和SLEDAI评分从表2中可以看出，尽管s-kl、25-OH-D和FGF-23在SLE组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)，但与对照组比较，SLE组s-kl和25-OH-D有下降,FGF-23有升高的趋势，而在LN组中s-kl、25-OH-D和FGF-23与对照组和SLE组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，并且，LN组SLEDAI评分比SLE组评分更高，病情活动更严重(P<0.05)。

表2　3组中s-kl,25-OH-D,FGF-23 及 SLEDAI

a：P<0.05,与对照组比较;b：P<0.05,与SLE组比较；-：此项无数据。

2.3s-kl与25-OH-D和FGF-23及与SLE病情活动有关指标的相关性分析结果提示，s-kl与25-OH-D、C3及C4呈正相关(P<0.05)，与FGF-23、SLEDAI评分和dsDNA呈负相关(P<0.05)。

表3　s-kl与25-OH-D、FGF-23、C3、C4及

2.4s-kl、25-OH-D和FGF-23与SLEDAI评分的线性回归分析为了进一步了解s-kl、25-OH-D和FGF-23能否预测SLE活动度，作者进行了线性回归分析，从结果可以看到，s-kl、25-OH-D和FGF-23与SLE活动度无依存回归关系，三者不能对SLE活动度做出预判。见表4。

表4　s-kl、25-OH-D和FGF-23与SLEDAI评分的

3讨论

klotho是一新发现的抗衰老基因，其表达缺失或降低可导致一系列表型与慢性肾脏病类似的临床表现，如动脉硬化、骨质疏松、免疫系统调节紊乱、氧化应激及生长发育迟滞和不孕不育等，又因肾脏是klotho基因表达的主要器官，其在肾脏疾病中的作用日益受到重视。klotho基因是一跨膜蛋白，以两种形式存在，即膜结合性klotho(membrane klotho，m-kl)和s-kl。研究认为，klotho作为重要的辅助因子，可诱导FGF-23对成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factors receptors，FGFRs)及下游信号分子的激活，从而使FGF-23发挥生物学效应。FGF-23是成纤维细胞生长因子家族成员之一，在骨组织中产生的一种激素样物质，其主要功能是参与维生素D(vitamin D，VitD)的代谢和钙磷调节。

SLE是一种涉及多系统多器官的自身免疫性疾病，肾脏是受累最严重的器官之一。越来越多的研究已经证明，SLE与动脉粥样硬化、氧化应激、免疫调节及代谢紊乱等密切相关，VitD的缺乏可能是SLE病情活动和进展的重要因素之一[4]。尤为重要的是，肾脏的受累和激素治疗后出现的钙磷失调和VitD水平下降，导致的骨质疏松，更是影响患者预后和生存质量的重要因素[5]。目前的研究表明，klotho具有调节和抑制上述病理过程的功能，但迄今为止，其在SLE和LN中的作用仍知之甚少。本研究初步研究了s-kl、FGF-23和25-OH-D在SLE和LN的水平。从研究结果中可以看到，虽然SLE患者与普通体检者血清中s-kl、FGF-23及25-OH-D水平差异无统计学意义(P>0.05)，但SLE患者体内s-kl和25-OH-D已有下降，且FGF-23出现上升趋势，而在LN患者中这一趋势更加明显，差异有统计学意义(均P<0.05)。SLE患者由于为了防止病情加重或复发而减少日晒，加之肾功能受损及激素的应用，导致体内VitD代谢障碍，普遍存在VitD缺乏，而SLE患者体内的VitD水平低下是与SLE疾病活动程度呈显著负相关的[6]。研究还发现，SLE患者中VitD缺乏症与自身抗体的产生[7]、糖脂代谢异常、冠状动脉粥样硬化、骨质疏松及疲乏关系密切，尽管这些观察结果有待得到更多试验的验证，但仍能提示VitD水平的低下可能影响SLE患者的长期生存率和病死率。最近的临床研究表明，补充VitD可以改善SLE患者体内免疫紊乱和特异性生物学指标的异常，并且SLE患者对服用较大剂量的ViD3呈现良好的耐受性[8]。

研究已经证明，FGF-23是一种由骨组织产生的激素，肾脏是其发挥生理学效应的重要靶器官之一，参与磷和VitD的代谢调节。在FGF-23基因缺陷的小鼠中，存在动脉硬化、骨质疏松、性腺功能减退、全身器官功能受损等表现，这一现象与SLE患者和klotho基因缺陷的表型特征有明显相似。研究发现，FGF-23发挥生物学效应存在一个反馈环路，FGF-23可下调肾脏25羟化D的1α羟化酶表达，抑制1,23-(OH)2D生成，同时1,23-(OH)2D也可通过作用于FGF-23启动子上游的VitD反应元件(vitamin D response elements,VDRE)增加FGF-23的合成，可能导致VitD抵抗。Lee等[9]和Lai等[10]研究发现，环孢素A可下调VitD受体表达，导致VitD抵抗，其在SLE患者体内的累积量与血清1,23-(OH)2D水平呈反比，与FGF-23呈正比，提示SLE患者体内FGF-23水平的上调可导致VitD水平的降低。结合本研究，与普通体检者比较，SLE和LN患者中FGF-23血清水平上升，而在LN患者中更加显著(均P<0.05)，由此推测FGF-23可能是影响SLE患者，尤其是LN患者体内影响VitD血清水平的关键因素之一。

迄今为止，klotho在肾脏病中的研究已成为热点，尤其在肾性骨病和慢性肾纤维化中的研究更为深入[11-12]，而klotho在SLE和LN中的研究罕见公开报道。klotho水平低下与大量蛋白尿和肾功能恶化密切相关，在本试验LN组患者再次得到验证。研究已证实，m-kl可与FGFRs结合形成klotho-FGFRs复合物，尽管s-kl不直接与FGF-23直接结合，但血中s-kl水平可反映肾组织中klotho蛋白表达水平，并能极大地增强FGF-23与klotho-FGFRs复合物结合的亲和力，从而使FGF-23失去生物学活性[13]。为了探讨s-kl在SLE中的作用，进一步的相关分析提示，s-kl与25-OH-D、C3及C4呈正相关(P<0.05)，与FGF-23、SLEDAI和dsDNA呈负相关(P<0.05)，表明klotho可能也是影响SLE活动的因素之一。但回归分析中并未发现s-kl、25-OH-D和FGF-23与SLE疾病活动度具有依存关系，提示三者不能对SLE活动度做出预判。

尽管本试验未能直接证明s-kl在SLE发病中的作用，但结合本研究结果和已有文献资料，作者推测SLE和LN患者体内s-kl水平的降低，可能是引起FGF-23升高的关键因素之一，由此进一步导致SLE和LN患者VitD缺乏和病情活动。

参考文献

[1]Fliser D,Seiler S,Heine GH,et al.Measurement of serum soluble Klotho levels in CKD 5D patients:useful tool or dispensable biomarker?[J].Nephrol Dial Transplantat,2012,27(5):1702-1703.

[2]Pavik I,Jaeger P,Ebner L,et al.Secreted klotho and FGF23 in chronic kidney disease stage 1 to 5:a sequence suggested from a cross-sectional study[J].Nephrol Dial Transplant,2013,28(2):352-359.

[3]Hochberg MC.Updating the American college of rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,1997,40(9):1725.

[4]Petri M,Bello KJ,Fang H,et al.Vitamin D in systemic lupus erythematosus:modest association with disease activity and the urine protein-to-creatinine ratio[J].Arthritis Rheum,2013,65(7):1865-1871.[5]Mok CC.Vitamin dandsystemic lupus erythematosus:anupdate[J].Expert Rev Clin Immunol,2013,9(5):453-463.

[6]Schoindre Y,Jallouli M,Tanguy ML,et al.Lower vitamin D levels are associated with higher systemic lupus erythematosus activity,but not predictive of disease flare-up[J].Lupus Sci Med,2014,1(1):e000027.

[7]Ritterhouse LL,Crowe SR,Niewold TB,et al.Vitamin D deficiency is associated with an increased autoimmune response in healthy individuals and in patients with systemic lupus erythematosus[J].Ann Rheum Dis,2011,70(9):1569-1574.[8]Terrier B,Derian N,Schoindre Y,et al.Restoration of regulatory and effector T cell balance and B cell homeostasis in systemic lupus erythematosus patients through vitamin D supplementation[J].Arthritis Res Ther,2012,14(5):R221.

[9]Lee CT,Ng HY,Lien YH,et al.Effects of cyclosporine,tacrolimus and rapamycin on renal calciumtransport and vitamin D metabolism[J].Am J Nephrol,2011,34(1):87-94.

[10]Lai CC,Chen WS,Chang DM,et al.Increased serum fibroblast growth factor-23 and decreased bone turnover in patients with systemic lupuserythematosus under treatment with cyclosporine and steroid but not steroid only[J].Osteoporos Int,2015,26(2):601-610.

[11]Zununi VS,Nikasa P,Ardalan M.Klotho and renal fibrosis[J].Nephrourol Mon,2013,5(5):946-948.

[12]Hu MC,Kuro-o M,Moe OW.Secreted klotho and chronic kidney disease[J].Adv Exp Med Biol,2012，728:126-57.

[13]Nitta K,Nagano N,Tsuchiya K.Fibroblast growth factor 23/klotho axis in chronic kidney disease[J].Nephron Clin Pract,2014,128(1/2):1-10.

The role of soluble klotho in patients with systemic lupus erythematosus*

LinShudian,ZhanFeng△,PanChuying,ZhangYan,Liuying,ZhanYuwei

(DepartmentofNephrologyandRheumatology,People′sHospitalofHainanProvince,Haikou,Hainan570001,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the serum concentration of soluble klotho (s-kl) in systemic lupus erythematosus (SLE) and lupus nephritis (LN),and elucidate its role in SLE and LN.MethodsA total of 34 patients，definitely diagnosis as SLE with un-treatment firstly，were enrolled in this study.The patient were divided into two groups,those who complicated with LN were assigned to LN group (15 cases),the others were distributed to SLE group (19 cases).At the same time,17 cases of routine physical examination people were take as control group.24 hours urine of all the cases was collected for examining urinary protein (Upro).Routine hemocyte analysis,serum biochemical parameters and ANA and dsDNA were measured by routine method.ELISA was used to detect s-kl,25-hydroxy vitamin D (25-OH-D) and fibroblast growth factor-23 (FGF-23).Systemic lupus erythematosus disease activity index (SLEDAI) was performed in SLE and LN group,and the creatinine clearance rate(CCr)was calculated according to the Cockcroft-Gault formula.Pearson′s and linear regression were applied to analyisis the correlation of relevant parameters.ResultsAs compared with the control group,there were statistically significant differences in mean arterial pressure,blood routine,creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH),complement (C3 and C4) and dsDNA in SLE and LN group (P<0.05).The level of Upro/24 h,lipids (CHOL and TG) and creatinine (Scr) in LN group was significantly higher,while serum albumin (ALB) and CCr were obviously lower than those in SLE group and control goup(P<0.05).Difference of s-kl,25-OH-D and FGF-23 in serum were not observed between SLE and control gropu(P>0.05),but the serum level of s-kl,25-OH-D and FGF-23 in LN group were showed a statistical significance when compared with SLE or control group(P<0.05).Meanwhile,the SLEDAI score was higher in LN than in SLE group(P<0.05).Correlation analysis indicted that s-kl exhibited a positive relationship with 25-OH-D,C3 and C4,while showed a negative correlation with FGF-23,SLEDAI and dsDNA(all P<0.05).However,no any correlationt was revealed in regression analysis between the s-kl,25-OH-D,FGF-23 and the lupus activity.ConclusionThe decrease of s-kl maybe one of the pivotal factors that up-regulated the level of FGF-23 in SLE and LN patients,thus lead to the deficiency of vitamin D and lupus activity.

[Key words]klotho;lupus;lupus erythematosus,systemic;nephritis;vitamin D

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.010

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81360118)；海南省自然科学基金资助项目(309087)。

作者简介：林书典(1974-)，副主任医师，博士，主要从事免疫性肾病、慢性肾脏病研究。 △通讯作者，E-mail:renal@126.com。

[中图分类号]R33

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)02-0176-04

(收稿日期：2015-08-22修回日期：2015-09-18)