APP下载

质膜Ca2+-ATP酶异构体2基因多态性与突发性耳聋的关系*

2016-06-14邓嘉虹

重庆医学 2016年1期
关键词:突发性耳聋多态性

邓嘉虹,金 磊

(1.云南省第一人民医院耳鼻喉科,昆明 650032;2.云南省昆明市延安医院耳鼻喉科 650000)



论著·临床研究

质膜Ca2+-ATP酶异构体2基因多态性与突发性耳聋的关系*

邓嘉虹1,金磊2△

(1.云南省第一人民医院耳鼻喉科,昆明 650032;2.云南省昆明市延安医院耳鼻喉科650000)

[摘要]目的探讨质膜Ca2+-ATP酶异构体2(PMCA2)基因的多态性与突发性耳聋的关系。方法采用分组研究的方法,对164名受检者进行调查和听力测试,按听力学评价的结果将其分为感音神经性听力损失的突发性耳聋组(n=82)和听力正常组(n=82);用PCR和等位基因特意扩增法检测PMCA2基因上rs2289274和rs6790640两个单核苷酸位点的多态性。结果在突发性耳聋组中,rs2289274位点基因型频率分别为AA 55.8%,AG 17.4%,GG 26.8%,等位基因频率A 64.5%和G 35.5%。在听力正常组中,rs2289274位点基因型频率分别为AA 26.8%,AG 28.0%,GG 45.2%,等位基因频率A 41.1%和G 58.9% 。在突发性耳聋组中,rs6790640位点基因型频率分别为CC 18.3%,CT 35.4%,TT 46.3%,等位基因频率C 36.3%和T 63.7%。在听力正常患者组中,rs6790640位点基因型频率分别为CC 2.4%,CT 63.4%,TT 34.1%,等位基因频率C 34.1%和G 65.9% 。两位点的基因型分布及其等位基因频率在突发性耳聋组和听力正常患者组之间部分差异有统计学意义(P<0.05)。结论PMCA2基因rs2289274和rs6790640两个单核苷酸位点的多态性可能是突发性耳聋的遗传易感性因素。

[关键词]钙转运ATP酶类;质膜Ca2+-ATP酶异构体;多态性,单核苷酸;突发性耳聋;疾病易感性

突发性感音神经性耳聋又称为突发性耳聋或特发性感音神经性耳聋,是指在几个小时至3 d之内发生的连续3个听觉频率存在至少30 dB[1]的感音神经性听力损失。全世界大约每年有15 000例[2]突发性耳聋新发病例,占突发性耳聋患者的1%。人类质膜Ca2+-ATP酶异构体2(PMCA2)基因定位于3号染色体,单核苷酸多态性位点众多,但大多数位于未转录区和内含子上,在翻译区有 8个位点存在无义突变,无错义突变,这些基因位点的多态性及其与突发性耳聋的相关性,将成为突发性耳聋病因学研究的重要手段[3]。因此,本研究将选择PMCA2基因上rs2289274和rs6790640两个单核苷酸位点,其中rs2289274位点存在A/G多态性,对应的编码产物为434位的天冬氨酸, rs6790640位点存在C/T多态性,对应的编码产物为1 185位的丝氨酸,本研究将探讨这两个位点的多态性与突发性耳聋的关系。

研究发现,核基因突变是耳聋的可能机制之一。可能涉及的基因包括PMCA2、热休克蛋白60/70(HSP60/70)基因、钙粘蛋白23(CDH23)基因、谷胱甘肽硫转移酶M1(GSTM1)和T1(GSTT1)基因、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因、血小板糖蛋白受体Ⅰα基因(GPⅠα)等[4-5]。对于核基因的多态性与突发性耳聋的关系,国外的研究涉及GSTM1/GSTT1、MTHFR和GPⅠα基因等。研究表明,谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,GSTs)是人体内一类具有解毒和抗氧化作用的重要酶类,可催化谷胱甘肽(GSH)的结合和运输,在抗氧化细胞中起关键作用,但GSTM1和GSTT1的多态性与突发性耳聋不具相关性[6-7]。而MTHFR作为与甲硫氨酸代谢和叶酸活化形式相关的同型半胱氨酸的3种酶成分之一,研究已证实其C677T和A1298C位点的突变可引起内皮细胞、血管平滑肌和细胞外基质的功能障碍[8-9];GPⅠa C807T的点突变可引起动脉血栓形成,上述二者都可引起耳蜗缺血性损害,造成耳聋[10-11];而目前,核基因的多态性与突发性耳聋的关系研究,在国内还处于空白。

1资料与方法

1.1一般资料突发性耳聋患者的纳入标准:几小时至3 d内发生的连续3个频率上存在至少30 dB的感音神经性听力损失,排除糖尿病、中风、心血管疾病、雌激素应用、眩晕、病毒感染、耳聋家族史、自身免疫性疾病和代谢性疾病等,所有患者进行纯音测听(包括125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000 Hz,ISO标准)、声阻抗、言语识别率测试、听觉脑干测听、眼震电图、头颅和内听道核磁共振等检查。听力正常组的纳入标准:排除糖尿病、中风、心血管疾病、雌激素应用、眩晕、病毒感染、耳聋家族史、自身免疫性疾病和代谢性疾病等的听力正常的其他患者,涉及病种包括鼻中隔偏曲、鼻息肉、声带息肉、慢性扁桃体炎、阻塞性呼吸暂停-低通气综合征、耳前瘘管、耳廓瘢痕等。按听力学评价结果,164名患者被分为两组:突发性耳聋组82名,听力正常组82名。两组患者一般资料情况见表1。

表1  突发性耳聋与听力正常组患者一般情况比较

a:两独立样本t检验;b:双侧χ2检验。

1.2方法

1.2.1DNA提取采集肘静脉血2 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,按照DNA提取试剂盒提供的方法提取基因组DNA,在-20 ℃保存。

1.2.2基因分型 采用PCR和等位基因特异扩增法分析PMCA2基因上rs2289274和rs6790640两个单核苷酸位点的多态性。引物设计采用Prime Primier5软件。扩增rs2289274引物序列:上游引物5′-GGT CAG CGT GCC TGT CTT-3′,下游引物5′-GGT GGC TCT GCC TTA TTT ACT-3′;PCR扩增204 bp的目的片段条件:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环;72 ℃再延伸5 min。扩增rs6790640引物序列:上游引物5′-GCT GTG GAT GGG GCT CCC TGG ACT C-3′,下游引物5′-CAT TGA TGA CAC CGA CCT G-3′;PCR扩增169 bp的目的片段条件:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环;72 ℃再延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳观察结果,通过紫外线成像系统进行区别。

2结果

在突发性耳聋组中rs2289274位点基因频率分别为AA 55.8%,AG 17.4%,GG 26.8%,等位基因频率是A 64.5%和G 35.5%。在听力正常组中,rs2289274位点基因型频率分别为AA 26.8%,AG 28.0%,GG 45.2%,等位基因频率是A 41.1%和G 58.9%;在突发性耳聋组中rs6790640位点基因型频率分别为CC 18.3%,CT 35.4%,TT 46.3%,等位基因频率是C 36.3%和T 63.7%。在听力正常组中,rs6790640位点基因型频率分别为CC 2.4%,CT 63.4%,TT 34.1%,等位基因频率是C 34.1%和T 65.9%。两位点的基因型分布及其等位基因频率在突发性耳聋组和听力正常组中,基因型分布及其等位基因频率部分差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、3。

表2  PMCA2-rs2289274位点基因型分布及其等位基因频率[n(%)]

表3  PMCA2-rs6790640位点基因型分布及其等位基因频率[n(%)]

3讨论

PMCA2在维持毛细胞静纤毛的功能完整性过程中起重要作用。Zanni等[12]的研究表明,静纤毛正常功能的实现需要高钙环境,Ca2+的缺乏会导致静纤毛排列紊乱,功能障碍。当静纤毛的微环境-内淋巴中的钙离子浓度降低时,定位于静纤毛上的质膜PMCA2能够在ATP的作用下将静纤毛中的钙离子泵入内淋巴,保持微环境中较高的Ca2+浓度。PMCA2的另一重要作用是清除对细胞可能产生毒性作用的胞内钙[13]。当细胞受外界有害条件刺激时会导致毛细胞静纤毛周围Ca2+浓度过高而对细胞造成损伤,PMCA2可将细胞内过多的Ca2+泵出而起到保护细胞的作用[14]。动物实验表明, PMCA2基因中一个高度保守氨基酸位点上的A>G突变导致编码产物甘氨酸(Gly)被丝氨酸(Ser)替换,在另一个位点由于两个碱基对的缺失引起的移码突变导致其所编码蛋白的长度缩短。因此基因突变小鼠的毛细胞静纤毛和基底侧壁中PMCA2表达缺失,可通过影响静纤毛上的感觉转换和基底膜神经递质的释放导致耳聋的发生[15-17]。国内仅杨杪等[18]对噪声性耳聋患者PMCA2两个单核苷酸位点(rs2289274和rs6790640)的多态性进行分析,发现rs2289274位点具有AA、AG、GG的基因型和rs6790640位点具有CC、CT、TT基因型,并发现噪声性耳聋PMCA2两个单核苷酸位点rs2289274和rs6790640都是阴性结果[18]。国内外很少有人研究突发性耳聋的病因,特别是PMCA2两个单核苷酸位点rs2289274和rs6790640与突发性耳聋关系的研究,所以本研究就突发性耳聋PMCA2两个单核苷酸位点rs2289274和rs6790640进行研究,并得到部分阳性结果: rs2289274位点在突发性耳聋组中基因型频率分别为AA 55.8%,AG 17.4%,GG 26.8%,等位基因频率A 64.5%和G 35.5%。在听力正常组中rs2289274位点基因型频率分别为AA 26.8%,AG 28.0%,GG 45.2%,等位基因频率A 41.1%和G 58.9%。rs6790640在突发性耳聋组中,位点基因型频率分别为CC 18.3%,CT 35.4%,TT 46.3%,等位基因频率C 36.3%和T 63.7%。在听力正常组中,rs6790640位点基因型频率分别为CC 2.4%,CT 63.4%,TT 34.1%,等位基因频率C 34.1%和T 65.9%。两位点的基因型分布及其等位基因频率在突发性耳聋组和听力正常组中,部分基因型AA,GG,CC,CT分布及其等位基因A,G频率差异有统计学意义(P<0.05),部分基因型AG,TT分布及其等位基因C,T频率差异无统计学意义(P>0.05)。通过实验进一步说明rs2289274和rs6790640这两个单核苷酸位点多态性可能是突发性耳聋易感因素,外因和内因通过多方面因素共同作用单基因的某一个或者几个位点,使其产生突变,从而影响PMCA2功能,进而造成突发性耳聋的发生。

由于突发性耳聋病因不明,其治疗一直是临床上棘手的问题。由于国内外多位学者已证实基因突变是耳聋的危险因素之一,只有找到基因突变的位点和类型,才有可能针对性的进行治疗[19]。突发性耳聋也可能是个多基因疾病,多个耳聋相关基因位点的突变与突发性耳聋的发生有关,除MTHFR和GPⅠa的基因突变可引起突发性耳聋的发生外,其他耳聋基因的突变将是突发性耳聋的潜在病因[20]。本试验利用分子生物学技术研究了PMCA2基因的多态性与突发性耳聋的相关性,将可能找突发性耳聋的病因,并通过进一步阐述突发性耳聋的病因机制,为下一步基因探针的制备和突发性耳聋基因诊断、治疗的开展打下基础。

参考文献

[1]Yoon-Hee C.Migraine a risk factor for SSNHL[J].Cephalalgia,2013,33(2):77-79.

[2]Alexander TH,Harris JP.Incidence of sudden sensorineural hearing loss[J].Otology Neurotol,2013,34(9):1586-1589.

[3]Giacomello M,De Mario A,Lopreiato R,et al.Mutations in PMCA2 and hereditary deafness:A molecular analysis of the pump defect[J].Cell calcium,2011,50(6):569-576.

[4]Süslü N,Yilmaz T,Gursel B.Utility of anti-HSP 70,TNF-alpha,ESR,antinuclear antibody,and antiphospholipid antibodies in the diagnosis and treatment of sudden sensorineural hearing loss[J].Laryngoscope,2009,119(2):341-346.

[5]Hashibe M,Brennan P,Strange RC,et al.Meta-and pooled analyses of GSTM1,GSTT1,GSTP1,and CYP1A1 genotypes and risk of head and neck cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2003,12(12):1509-1517.

[6]Hiramatsu M,Teranishi M,Uchida Y,et al.Polymorphisms in genes involved in inflammatory pathways in patients with sudden sensorineural hearing loss[J].J Neurogenet,2012,26(3/4):387-396.

[7]Capaccio P,Ottaviani F,Cuccarini V,et al.Genetic and acquired prothrombotic risk factors and sudden hearing loss[J].Laryngoscope,2007,117(3):547-551.

[8]Capaccio P,Ottaviani F,Cuccarini V,et al.Sudden hearing loss and MTHFR 677C>T/1298A>C gene polymorphisms[J].Genet Med,2005,7(3):206-208.

[9]Klerk M,Verhoef P,Clarke R,et al.MTHFR 677C→ T polymorphism and risk of coronary heart disease:a meta-analysis[J].JAMA,2002,288(16):2023-2031.

[10]Benze G,Heinrich J,Schulte H,et al.Association of the GPIa C807T and GPIIIa PlA1/A2 polymorphisms with premature myocardial infarction in men[J].Eur Heart J,2002,23(4):325-330.

[11]Rudack C,Langer C,Junker R.Platelet GPIaC807T polymorphism is associated with negative outcome of sudden hearing loss[J].Hear Res,2004,191(1/2):41-48.

[12]Zanni G,Cali T,Kalscheuer VM,et al.Mutation of plasma membrane Ca2+ATPase isoform 3 in a family with X-linked congenital cerebellar ataxia impairs Ca2+homeostasis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(36):14514-15149.

[13]Antalffy G,Mauer AS,Pászty K,et al.Plasma membrane calcium pump (PMCA) isoform 4 is targeted to the apical membrane by the w-splice insert from PMCA2[J].Cell Calcium,2012,51(2):171-178.

[14]Spiden SL,Bortolozzi M,Di Leva F,et al.The novel mouse mutation Oblivion inactivates the PMCA2 pump and causes progressive hearing loss[J].PLoS One,2008,4(10):e1000238.

[15]Grati MH,Aggarwal N,Strehler EE,et al.Molecular determinants for differential membrane trafficking of PMCA1 and PMCA2 in mammalian hair cells[J].J Cell Sci,2006,119(14):2995-3007.

[16]Schultz JM,Yang Y,Caride AJ,et al.Modification of human hearing loss by plasma-membrane calcium pump PMCA2[J].N Engl J Med,2005,352(15):1557-1564.

[17]Reinhardt TA,Lippolis JD,Shull GE,et al.Null mutation in the gene encoding plasma membrane Ca2+-ATPase isoform 2 impairs calcium transport into milk[J].J Biol Chem,2004,279(41):42369-42373.

[18]杨杪,谭皓,郑建如.质膜Ca2+-ATP酶异构体2基因多态性与噪声性听力损失易感性的关系[J].中国工业医学杂志,2005,18(1):19-22.

[19]Su CX,Yan LJ,Lewith G,et al.Chinese herbal medicine for idiopathic sudden sensorineural hearing loss:a systematic review of randomised clinical trials[J].Clin Otolaryngol,2013,38(6):455-473.

[20]Dispenza F,De Stefano A,Costantino C,et al.Sudden sensorineural hearing loss:results of intratympanic steroids as salvage treatment[J].Am J Otolaryngol,2013,34(4):296-300.

Association between poly-morphism of Ca2+-ATPase isomer 2 gene in plasma membrane and sudden deafness*

DengJiahong1,JinLei2△

(1.DepartmentofE·N·T,theFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650032,China;2.DepartmentofE·N·T,Yan′anHospital,Kunming,Yunnan650000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the association between polymorphisms of Ca2+-ATPase isomer 2 gene (PMCA2) in plasma membrane and the development of sudden deafness.MethodsTotally,164 patients were investigated and hearing tests were conducted.According to the results of audiometry,they were divided into two groups,sensorineural hearing loss group(n=82) and normal hearing group(n=82).Polymorphisms of two single nucleotide loci rs2289274 and rs6790640 in the PMCA2 gene were determined by polymerase chain reaction followed by allele specific amplication analysis.ResultsIn the sudden deafness group,frequencies of genotypes AA,AG and GG in the rs2289274 locus were 55.8%,17.4% and 26.8% respectively,while frequencies of alleles A and G in the same locus were 64.5% and 35.5% respectively;in the sensorineural hearing loss group,were 26.8%,28.0% and 45.2% respectively,while frequencies of alleles A and G were 41.1% and 58.9%.And,in the sudden deafness group,frequencies of genotypes CC,CT and TT in the rs2289274 locus were18.3%,35.4% and 46.3% respectively,while frequencies of alleles C and T in the same locus were 36.3% and 63.7%;in the normal hearing group,were 2.4%, 63.4% and 34.1% respectively,while frequencies of alleles C and T were34.1% and 65.9%,respectively.Genotypes distribution of two sites and their allele frequencies of the two groups,some differences of them had statistical significance(P<0.05).ConclusionIt is suggested that genetic polymorphism of the rs2289274 and rs6790640 loci in the PMCA2 gene might be a susceptible factor for sudden deafness.

[Key words]calcium-transporting ATPases;PMCA2;polymorphism,single nucleotide;sudden deafness;disease susceptibility

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.019

基金项目:云南省科技厅联合专项(CD190)。

作者简介:邓嘉虹(1975-),副主任医师,博士,主要从事耳聋基因相关研究。△通讯作者,E-mail:cou68_deng@sina.com。

[中图分类号]R764.437

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)01-0056-03

(收稿日期:2015-03-22修回日期:2015-06-28)

猜你喜欢

突发性耳聋多态性
单核苷酸多态性与中医证候相关性研究进展
MTHFR C677T基因多态性与颈动脉狭窄及其侧支循环形成的关系
ESR与NCOA1基因多态性对大白猪繁殖性能的影响
突发性耳聋的流行病学调查
葛根素联合利多卡因对突发性耳聋的治疗效果观察
突发性耳聋伴眩晕的临床特征探讨
突发性耳聋120例疗效与预后的影响因素分析
甲钴胺对64例突发性耳聋患者耳鸣症状的疗效观察
α1抗胰蛋白酶基因多态性与肺癌易感性的研究
蒙古斑在维吾尔族新生儿中分布的多态性