超声波辅助法和乙醇回流法提取葛根素

王振伟，胡晓冰，陈西良（黄河水利职业技术学院，应用化学研究中心，河南开封475000）



超声波辅助法和乙醇回流法提取葛根素

王振伟，胡晓冰，陈西良
（黄河水利职业技术学院，应用化学研究中心，河南开封475000）

摘要：用乙醇做溶剂，分别采用超声辅助法和回流法从葛根中提取有效成分葛根素，考察了反应时间、反应温度、固液比、乙醇浓度等因素对提取率的影响，并采用正交设计进行了优化。研究结果表明，乙醇回流法提取葛根素的最佳工艺条件为：乙醇浓度75%，提取温度90℃，提取时间90 min，固液比为1∶20（g/mL），葛根素的提取率为86.20%；超声波辅助法提取葛根素的最佳工艺条件为：乙醇浓度60%，提取温度80℃，固液比为1∶20（g/mL），提取时间50 min，葛根素的提取率为95.85%。超声波辅助提取的提取率明显高于乙醇回流法。

关键词：葛根素；超声波；回流

葛根素属于异黄酮类化合物，是葛属植物的特征成分。葛根素具有广泛的药理活性，特别其是对心血管疾病具有良好的疗效，因此具有重要的医疗和保健价值［1］。

目前葛根素的提取方法主要有浸渍法、醇回流法、微波法、超声法、超临界萃取法等。潘见［2］和李稳宏等人［3］分别采取醇浸取和醇回流的方法优化葛根黄酮提取工艺，取得了较高的提取率，并且固液分离过程也比水提法容易得多。李芙蓉［4］首次运用微波法从葛根中提取总黄酮，测得葛根中总黄酮含量为0.34%，平均回收率达到97.6%。王龙虎等人［5］采用超临界流体萃取的方法，系统地考察了原料、温度、压力、CO2流量、萃取时间和共溶剂用量等条件对提取率的影响。相比而言，微波法、超临界流体萃取等方法可以得到较高的提取率，并且耗时少，但是需要特殊的设备；浸取法和醇回流法所需仪器简单，更加容易满足，但是所需的时间较长。

超声波的空化作用可以产生强大的剪切力，从而使植物细胞壁破裂，有助于有效成分的溶出与释放；超声波的振荡和加热作用，有利于溶质扩散［6］，从而提高提取率，但是目前采用超声法提取葛根素的研究相对于其它几种方法还不够完善［7-8］。本文采用醇回流法和超声波辅助法从葛根中提取葛根素，系统研究提取时间、提取温度、乙醇浓度、固液比等因素对提取率的影响，正交试验优化乙醇回流提取工艺和超声辅助提取工艺，为葛根中葛根素的开发和利用提供试验参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

葛根：河南省开封市医药大厦；葛根素标准品（纯度＞99%）：西安中鑫生物技术有限公司；无水乙醇：天津市德恩化学试剂有限公司；D101大孔吸附树脂：开封化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：河南智诚科技发展有限公司；超声波组织粉碎仪：南京先欧仪器制造有限公司。

1.3方法

D101型大孔吸附树脂用无水乙醇充分溶胀装柱，依次用乙醇、去离子水洗净备用。葛根干燥、粉碎、过100目筛后备用。

称取一定量粉碎后的葛根置于回流装置内，分别在固液比为1∶20（g/mL）、乙醇浓度70%、回流时间120 min的情况下研究反应温度对提取效果的影响；在固液比1∶20（g/mL）、乙醇浓度70%、反应温度80℃情况下研究不同的回流时间对提取效果的影响；在乙醇浓度70%、反应温度90℃、回流时间120 min情况下研究不同的固液比对提取效果的影响；在固液比1∶20（g/mL）、反应温度80℃、回流时间120 min情况下研究不同的乙醇浓度对提取效果的影响。回流完毕后抽滤，所得澄清溶液用D101大孔吸附树脂分离纯化，测定葛根素含量，计算提取率。超声辅助法提取葛根素时，将装有葛根素和乙醇溶液的回流装置放入超声水浴中，设置超声波功率为200 W，其它步骤与醇回流法相同。

葛根中葛根素含量的测定参照文献［9］，称取10 g葛根以80%乙醇回流提取，过滤后的滤渣继续回流提取，直至提取液中检测不到葛根素为止，将所得提取液合并，即可得到葛根中葛根素的总量，试验发现葛根素的含量为38.021 mg/g。

精密称取干燥的葛根素标准品5.0 mg溶解于50 mL 95%乙醇中配制成0.1 mg/mL的标准溶液，量取1 mL于10 mL比色管中用95%乙醇稀释定容后做光谱扫描分析，葛根素标准品的紫外可见吸收光谱如图1所示。

图1　葛根素溶液的紫外可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis spectrum of puerarin solution

葛根素对在紫外区250 nm处具有稳定的特征吸收峰［10］。

分别量取葛根素对照品标准溶液0.0、0.2、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于8支10 mL闭塞管中，用95%乙醇定容，在250nm处测定其吸光度，以葛根素浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图2所示，标准曲线回归方程为：A=6.820 5C+0.132，R2=0.994，其中A为吸光度，C为葛根素的浓度。

图2　葛根素溶液标准曲线Fig.2 The standard curve of puerarin solution

2　结果与讨论

2.1乙醇回流法提取试验结果

2.1.1乙醇回流单因素试验

以葛根素提取率为评价指标进行单因素试验，乙醇回流法提取时间对提取率的影响结果如图3所示。

图3　时间对葛根素提取率的影响Fig.3 Effects of time on extraction rate

随着提取时间的增加，提取率不断地增加，并且在120 min时提取率达到最大值，继续延长提取时间，葛根素的提取率反而下降，这可能是葛根素的水解反应所致。120 min左右的时间，葛根素的溶解、析出已经达到平衡，过度延长时间可能会导致副反应的发生，使部分葛根素发生分解，从而降低了提取率。因此，最佳的提取时间为120 min。

图4　温度对葛根素提取率的影响Fig.4 Effects of temperature on extraction rate

由图4可知，葛根素得率随反应温度的升高而不断增大，这是因为温度的提高可加剧分子的运动，促进水解反应，促进葛根素的溶出。温度增加到一定程度后，葛根素的浸出量几乎达到饱和。

乙醇浓度对提取率的影响如图5所示。

图5　乙醇浓度对葛根素提取率的影响Fig.5 Effects of ethanol concentration on extraction rate

随着乙醇浓度的增大，葛根素提取率不断增大，但增加的幅度不大。但当乙醇浓度超过80%时，提取率急剧减小。这是由于乙醇和水均属于极性溶液，水的极性大于乙醇。随着乙醇比例的增大，溶液的极性不断减小，导致提取溶剂对葛根素的溶解度降低。试验中也发现，提取液的混浊度随乙醇浓度的增大而减小。这是由于在葛根的有效成分中，另一种重要成分葛根多糖同样具有水溶性，在低浓度乙醇溶液中容易被提取出来，故提取液比较浑浊，而在高浓度乙醇溶液中，多糖的溶解度降低，导致溶液较为透明。综合考虑认为，以80%乙醇为提取剂提取葛根素，不但有利于葛根素的浸出，而且可以抑制其它物质的溶解。

葛根素的提取率随固液比的增大而增大，如图6所示。

图6　固液比对葛根素提取率的影响Fig.6 Effects of liquid-solid ratio on extraction rate

当固液比达到1∶30（g/mL）后，提取率开始呈现下降的趋势。考虑到采用较大的固液比时，不仅增加了乙醇的用量，还增大了浓缩分离等工序的难度，故选用1∶30（g/mL）的固液比作为最优选择。

2.1.2乙醇回流正交设计试验

为了确定在提取过程中各因素的影响大小，根据单因素试验结果，选取固液比、乙醇浓度、提取温度、加热回流时间作为考察因素，以葛根素提取率为指标，各取4个水平，进行L16（44）正交试验，以确定乙醇回流法提取葛根中葛根素的最佳工艺条件，正交试验因素与水平设计如表1。

表1　L16（44）正交试验因素与水平设计Table 1 L16（44）Factors and levels of orthogonal test design

按照表1设计的因素和水平进行正交试验，经计算提取率结果如表2所示。

正交试验的R值分析结果显示：以葛根素提取率为评价指标，各因素对提取效果的影响程度依次为：乙醇浓度＞温度＞固液比＞时间。综合分析正交试验结果，确定最佳提取组合为A1B2C3D3，即最佳提取工艺条件为固液比1∶20（g/mL），乙醇浓度75%，时间90 min，温度90℃。经试验验证，在此条件下得到葛根素的提取率为86.20%。

2.2超声波辅助提取试验结果

2.2.1超声波单因素试验及分析

在200 W超声功率下，以葛根素提取率为评价指标，进行超声波辅助提取葛根素的单因素试验，乙醇浓度对提取率的影响如图7所示。

表2　乙醇回流提取葛根素的正交试验结果Table 2 Orthogonal test results of extracting puerarin via alcohol refluxing method

图7　乙醇浓度对葛根素提取率的影响Fig.7 Effects of ethanol concentration on extraction rate

随着乙醇浓度的增大，葛根素提取率不断增大。当乙醇浓度为65%时，提取率达到极大值，当乙醇浓度继续增大时提取率反而急剧减小，所以选择乙醇浓度为65%。超声波可以有效地提高提取率，随着时间的增大，提取率也在增加（如图8所示）。

图8　时间对葛根素提取率的影响Fig.8 Effects of ultrasonic time on extraction rate

但在超声时间超过60 min后，提取率反而下降，原因是超声波空化破碎作用可以在较短时间内达到较高的提取率。由于反应时间相比回流法短，可以有效降低葛根素的降解，所以提取率比回流法有所提高。在60 min后，由于葛根素的降解使提取率下降。

超声温度对提取率的影响如图9所示。

图9　温度对葛根素提取率的影响Fig.9 Effects of temperature on extraction rate

随着温度升高，葛根素的提取率不断提高。当温度超过70℃时，提取率升高的幅度变缓，原因主要是葛根富含淀粉，温度过高容易产生糊化，不利于葛根素的溶出。

葛根素的提取率随固液比的变化如图10所示。

图10　固液比对葛根素提取率的影响Fig.10 Effects of liquid-solid ratio on extraction rate

随着固液比的增加，对葛根素的溶出更加充分，因此提取率增大。但是当固液比超过1∶40（g/mL）时，提取率开始降低。这是由于超声波在溶液中传播时，声波的能量随着传播距离的增加急速衰减。随着固液比的增加，体系中总的溶液体积增大，在距离声源较大的距离处，超声波能量降低，空化能力削弱，不利于葛根素的溶出。另外，液体对超声波的吸收衰减，也是导致超声波随体系增大而快速衰减的原因。

2.2.2超声波辅助正交试验

为了确定在超声波辅助提取过程中各因素对提取结果影响的大小，根据单因素试验结果，选取固液比、乙醇浓度、提取温度、加热回流时间作为考察因素，在200 W的超声波功率下，以葛根素提取率为指标，各取4个水平，进行L16（44）正交试验，以确定葛根中的葛根素最佳提取工艺条件，正交试验因素与水平设计如表3。

表3　L16（44）正交试验因素与水平设计Table 3 L16（44）Factors and levels of orthogonal test design

按照表3设计的因素和水平进行正交试验测定，方法同上，经计算提取率结果如表4所示。

表4　超声波辅助法回流提取葛根素的正交试验结果Table 4 Orthogonal test results of extracting puerarin via ultrasonic method

通过正交试结果的分析，影响试验效果的因素依次是：固液比＞乙醇浓度＞温度＞时间。由此可确定最优的试验条件为固液比1∶20（g/mL），乙醇体积分数60%，超声波时间为50 min，超声波浸提的温度80℃。经试验验证在此条件下可得到葛根素的提取率为95.85%。采用超声波辅助提取葛根有效成分，能明显的提高提取率。同时，由于超声的空化作用，可以显著提高葛根素的溶解和扩散，有利于成分的溶出，所以反应时间更短，所需的反应温度、乙醇浓度也更低。

3　总结

采用乙醇回流法提取葛根素的最佳工艺条件为：乙醇浓度75%，提取温度90℃，提取时间90 min，固液比为1∶20（g/mL），葛根素的提取率为86.20%。而超声波辅助法提取葛根素的最佳工艺条件为：乙醇浓度60%，提取温度80℃，固液比为1∶20（g/mL），提取时间50 min，葛根素的提取率为95.85%。超声波辅助法的提取率明显高于乙醇回流法，并且所需乙醇浓度更低、反应时间更短，有利于工艺的推广应用。

参考文献：

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［4］李芙蓉，吕博．葛根中总黄酮的微波提取及含量测定［J］.新疆中医药，2002，20（6）：9-10

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［7］贺云，贺武卫．超声提取和超声水解法从野葛根中提取纯化葛根素和大豆苷元［J］.天然产物研究与开发，2005，17（3）：328-330

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Extracting Puerarin with Ultrasonic Assisted and Alcohol Refluxing Method

WANG Zhen-wei，HU Xiao-bing，CHEN Xi-liang
（Applied Chemistry Research Center，Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475004，Henan，China）

Abstract：Active ingredients puerarin was extracted from pueraria via ultrasound method and reflux method，respectively. Effects of reaction time，reaction temperature，solid-liquid ratio，ethanol concentration on the extraction rate were investigated. And then optimized process was designed through orthogonal design. The results demonstrated that the optimum conditions by ethanol extraction was ethanol concentration 75%，extraction temperature 90℃，extraction time 90 min，solid-iquid of 1∶20（g/mL）. The resulting extracting rate of puer arin was 86.20%. The optimum conditions of ultrasonic assisted extraction method was ethanol concentration 60%，extraction temperature 80℃，solid-liquid ratio of 1∶20（g/mL），extraction time 50 min. The puerarin extraction rate was up to 95.85%. The extraction rate by ultrasonic way was significantly higher than the way of ethanol refluxing.

Key words：puerarin；ultrasonic wave；refluxing

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.011

基金项目：河南省教育厅科学技术项目（14B550010）；河南省教育厅科学技术重点项目（14B150008）；黄河水院科学技术项目（2013KXJS009）

作者简介：王振伟（1980—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物提取与开发。

收稿日期：2015-03-25