曲尼司特对犬自体静脉移植术后再狭窄的影响

马英初，孙成林

（1.沈阳医学院附属中心医院 放射科，辽宁 沈阳110024；2.普外一科）

自体静脉移植被广泛应用于治疗动脉闭塞性疾病，但由于术后再狭窄严重影响了远期疗效。血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖是静脉移植术后再狭窄的主要病理基础[1,2]，在血管内膜增生及血管重塑中起重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素血管紧张素系统的关键效应分子，可刺激VSMC肥大和增殖，导致血管壁增厚、管腔缩小进而导致血管狭窄，在血管重构中占重要地位[3]。在人、犬血管组织中AngⅡ的生成主要是由糜酶介导的[4]。曲尼司特作为一种能稳定肥大细胞膜的抗过敏药，对糜酶的释放及其介导的AngⅡ的生成起一定的抑制作用，本研究通过建立犬自体静脉移植模型观察曲尼司特对其术后再狭窄的影响。

1　材料与方法

1.1　试剂和器材

曲尼司特 (中国药科大学制药有限公司)，PCNA抗体及SP免疫组化染色试剂盒（武汉Boster公司），Trizol试剂盒购自BBI公司等；图像分析采用电子计算机图像分析仪(Luzex-F NIRECO)。

1.2　动物分组及模型的建立

成年健康犬12只，雌雄不限，体重约为10 kg。随机分为两组各6只：实验组每日给予曲尼司特50 mg/kg，对照组给予等量生理盐水。喂药采用强制灌胃法，喂药一周后行静脉移植术。术后继续用药两周（剂量同前）。

3%戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉后，取颈部竖切口，游离出左侧颈静脉和颈总动脉，取颈静脉的分支长约2 cm，将颈静脉间置移植于颈总动脉，吻合通畅后缝合切口。术后2周处死取材，取材血管分成两部分，用于形态学观察的部分常规福尔马林固定，用于测定糜酶mRNA的部分经0.9%氯化钠溶液冲洗干净后放入液氮保存。对照组未手术侧正常颈静脉分支作为空白对照组。

1.3　形态学观察

静脉血管常规福尔马林固定、包埋，HE及弹力纤维染色，电子计算机图象分析仪观察内膜厚度变化（血管横截面内膜，每60度测量1次该处内膜厚度，共6处，计算平均厚度）。

1.4　增殖细胞核抗原（PCNA）的观察

标本用PCNA抗体，SP法染色，定位于细胞核内，阳性结果为细胞核呈棕褐、棕黄、浅黄色。非移植颈静脉作为空白对照，计数每个视野PCNA阳性细胞数，以阳性细胞为分子计算PCNA表达指数并用百分比表示。

1.5　局部血管糜酶mRNA表达的测定

采用RT-PCR检测糜酶mRNA的表达，样品总RNA提取采用Trizol试剂盒，操作按试剂盒说明进行。chymase 上游引物：5’-gag gca gaa gct gag gag atc at-3’；下游引物：5’-gag cct gat cca ttg act tat ct-3’；产物长度：431 bp。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描，软件分析并计算chymase/β-actin吸光度(A)的比值。

1.6　统计学分析

实验数据采用SPSS 10.0进行分析，数据以（±s）表示，行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　静脉内膜厚度(mm)及PCNA指数(%，±s)

表1　静脉内膜厚度(mm)及PCNA指数(%，±s)

注:*与空白对照组比较，P＜0.05；△与对照组比较，P＜0.05

组别　空白对照组　对照组　实验组内膜厚度　0.34±0.19　1.87±0.74*　1.17±0.39*△PCNA 指数　0.21±0.13　32.14±3.87*17.62±2.81*△

图1　各组糜酶mRNA的表达结果

2　结果

2.1　形态学观察结果

静脉移植术后对照组可见移植静脉内膜比正常非移植静脉内膜增生明显(P＜0.05)，应用曲尼司特后，与正常非移植静脉相比移植静脉内膜有所增生(P＜0.05)，但与对照组相比移植静脉内膜增生受到抑制，内膜的平均厚度均减少(P＜0.05)（表1）。

2.2　PCNA免疫组织化学结果

正常静脉平滑肌细胞仅极少呈PCNA染色阳性，对照组术后内膜与中膜SMC的PCNA阳性细胞明显增多，而实验组PCNA指数均低于对照组，两者之间差异有显著性(P＜0.05)（表1）。

2.3　糜酶mRNA的表达结果

对照组血管糜酶表达较空白对照组明显增加(P＜0.05)；曲尼司特组较对照组明显下降 (P＜0.05)，接近空白对照组,与之比较差异无统计学意义(P＞0.05)(图 1)。

3　讨论

近年研究证实，静脉移植术后再狭窄的重要原因为血管平滑肌细胞和内皮细胞增生，而AngⅡ被认为在此过程中起重要作用。人体局部组织（包括血管、脑、心等）存在着肾素-血管紧张素系统，能分泌血管紧张素，在调节肌性内膜对血管损伤所发生的增生反应方面起重要作用[3]。很多动、静脉壁均有血管紧张素转换酶及其特异的AngⅡ受体[5]，当AngⅡ与AngⅡ受体结合作用于VSMC，可刺激c-fos和c-myc原癌基因的表达，由于这些基因产物的介导作用，使VSMC表型转换，由收缩型转变成分泌型，并产生弹性蛋白、糖氨多糖及胶原等(形成再狭窄病变的主要成分)，导致静脉VSMC增生[6]、血管狭窄。

人类心血管系统存在多种非血管紧张素转化酶(ACE)依赖的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)生成途径，其中又以糜酶(chymase)途径最为重要。糜酶在正常血管组织中以非活性形式贮存于肥大细胞内，免疫组化及原位杂交等实验方法都表明肥大细胞的分泌颗粒是合成和贮存糜酶的场所，当肥大细胞受到如血管移植、导管损伤等强烈刺激时随即被激活，并马上将糜酶释放到细胞外基质，与底物AngⅠ结合生成AngⅡ，使AngⅡ浓度迅速升高，这表明糜酶主要在病变血管生成AngⅡ起重要作用[7,8]。本研究亦发现静脉移植术后局部血管糜酶的mRNA表达显著增加，而曲尼司特能明显抑制其表达。

在犬颈动脉球囊损伤模型中，Takai等[9]发现损伤后的颈动脉局部内膜增生同时糜酶活性增大，而ACE活性无变化。给予糜酶抑制剂NK 3201后，局部颈动脉血管的糜酶活性被明显抑制，与对照组比较血管内膜增生面积明显减小，而血浆肾素和ACE活性无变化。提示NK3201通过抑制糜酶起到预防球囊损伤动脉的内膜增生的作用。说明糜酶主要调节损伤的血管局部AngⅡ水平，而在正常血管组织和整体中对AngⅡ生成影响基本不起作用。

在本研究中发现正常静脉PCNA阳性细胞很少，提示细胞大多处于增殖静止期，而在移植血管中阳性细胞很多，说明细胞增殖活性明显增大，PCNA在血管细胞中阳性率与血管内膜增生程度呈正相关。研究还观察到，移植术后血管内膜的平均厚度和PCNA表达在实验组均降低，表明曲尼司特对移植静脉增生内膜的PCNA表达有抑制作用。静脉移植术可导致糜酶的mRNA表达增加伴有细胞增殖和内膜增厚的现象，而曲尼司特通过抑制糜酶mRNA的表达减轻细胞增殖和内膜增厚的程度。曲尼司特作为一种能稳定肥大细胞膜的抗过敏药，可对糜酶的释放及其介导的AngⅡ的生成起一定的抑制作用，进而起到降低静脉移植术后再狭窄的效应。

总之，本研究通过建立犬静脉移植模型观察到曲尼司特对糜酶介导的血管组织增殖有抑制作用，证实了糜酶途径在AngⅡ增高所致的VSMC增殖相关性疾病中起着重要作用，通过药物阻断糜酶途径进而抑制VSMC增殖，为临床治疗VSMC增殖相关性疾病(如血管移植术后再狭窄等)提供了一条新途径。