黄鳝白头病病原菌的分离鉴定及药敏试验

2016-06-13曾明华

长江大学学报(自科版) 2016年9期

关键词：黄鳝单胞菌病原菌

曾明华

(长江大学动物科学学院，湖北荆州434025)

张治平

(湖北省荆州市水产技术推广中心，湖北荆州434000)

高帅，庄健

(长江大学动物科学学院，湖北荆州434025)

杨代勤

(长江大学动物科学学院，湖北荆州434025；湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北荆州434025)

黄鳝白头病病原菌的分离鉴定及药敏试验

曾明华

(长江大学动物科学学院，湖北荆州434025)

张治平

(湖北省荆州市水产技术推广中心，湖北荆州434000)

高帅，庄健

(长江大学动物科学学院，湖北荆州434025)

杨代勤

(长江大学动物科学学院，湖北荆州434025；湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北荆州434025)

[摘要]对患白头病黄鳝(Monopterus albus)的肝和肾进行了常规细菌学检查以及病原菌的形态观察和生理生化特性分析，结果表明：该病原菌为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。回归感染试验和药敏试验结果表明：该菌株对头抱曲松、氟哌酸、复方新诺明3种药物高度敏感，对氧氟沙星、氨苄西林、乙酰螺旋霉素、四环素、青霉素、强力霉素6种药物耐药。因此，头抱曲松、氟哌酸和复方新诺明应作为治疗此病的备选药物。

[关键词]黄鳝 (Monopterus albus)；白头病；温和气单胞菌(Aeromonas sobria)；药敏试验

白头病是危害黄鳝的细菌病之一，主要在引种后的15d内发生，黄鳝身体受伤后继发性感染，有传染快、死亡率高等特点，每年给黄鳝养殖业带来巨大的经济损失。杨代勤[1]首次报道了黄鳝白头病的发生，其症状为吻部前端发炎，颜色发白，病鳝离群，头部常伸出水面，活力较弱。温和气单胞菌属单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，是水产养殖中一种常见的条件性致病菌。已报道可感染的水产动物有金鱼[2]、异育银鲫[3]、斑点叉尾鮰[4]、黄沙鳖[5]等。该菌也可引起人类食物中毒和败血症等[6]，是人鱼共患的病原菌。本研究通过常规鉴定方法对致病菌进行鉴定，并进行了药敏试验，以期为该病的防治提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料

患病黄鳝采自长江大学动物科学学院黄鳝研究所，体长25～30cm，体重(50.80±5.22)g。主要症状为：黄鳝头部及其下层肌肉出现红斑，周围组织成黑色，尾、头或腹部可见皮肤发白溃疡，重者溃疡烂穿露出骨骼和内脏，伴有红肿出现。健康黄鳝由长江大学动科院黄鳝研究所提供，体重(50.30±2.60)g，体质健壮无病症，试验前水族箱暂养7d。

1.2试验方法

1.2.1病原菌的分离纯化

取发病症状典型的黄鳝，无菌操作条件下从病鳝肝和肾等取样，划线接种于普通营养琼脂培养基，28℃恒温培养24h。待平板上长出形态一致的优势菌落后，挑选单个优势菌落再次划线分离,28℃培养24h后经过多次纯化获得纯培养的菌株，并转接到斜面培养后于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2分离株的鉴定

将菌落接种于微生物生化鉴定管中，28℃恒温培养24h观察结果。各项生理生化试验按中国科学院微生物研究所细菌分类组[7]的方法进行生化测试，参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]的方法进行鉴定。

1.2.3回归感染试验

1)注射感染无菌生理盐水稀释纯化的菌落，采用分光光度计将浓度调节为3.0×106CFU/mL、3.0×107CFU/mL、3.0×108CFU/mL。取健康黄鳝30尾，腹腔注射菌悬液，每个浓度注射10尾，剂量均为0.lmL/尾，取同样大小的健康黄鳝10尾，同样注射无菌生理盐水(pH7.2)为对照组。感染组、对照组置于不同水族箱中，于25℃水温下饲养，每天观察发病与死亡情况，并对濒死的黄鳝及时进行剖解和致病原菌的分离鉴定。以被感染黄鳝出现同自然病例同样的病变、从感染发病黄鳝中重新分离到原感染菌作为相应致病菌的判定指标。致病性的结束时间以不再发生死亡为止。

2)浸泡感染取暂养7d后的健康黄鳝采用2种方式浸浴感染。一种人为创伤感染，即先用无菌刀片划破黄鳝体侧皮肤后放入浓度为3.0×106、30×107、3.0×108CFU/mL的菌悬液中浸浴；另一种将未损伤皮肤的黄鳝作同样浸浴。每组10尾，浸浴2h后转入不同水族箱内饲养并正常管理，致病性试验的结果观察与分析方法同上。

1.2.4药敏试验

将28℃培养24h的菌苔用无菌生理盐水调成菌悬液后，取0.lmL均匀涂布于营养琼脂平板上，然后贴上药物敏感试纸，恒温28℃培养24h后，观察并记录抑菌圈有无及直径大小，根据其抑菌圈直径判断菌株对药物的敏感性结果。检测标准为直径d>25mm高度敏感；15mm

2结果与分析

表1　所分离菌株的生化特性

注：表中符号“+”表示阳性；“-”表示阴性。

2.1病原菌的分离鉴定

2.1.1分离菌的形态特征

从病鳝的肝、肾脏中分离到一疑似致病菌株，命名为hs-1菌。该病菌在普通营养琼脂平板上能正常生长，菌落呈圆形、边缘整齐、中央微隆起、半透明。

革兰氏染色后，观察可见：革兰氏阴性、单极生鞭毛、无芽孢、两端钝圆、单个或2个相连排列、大小多在(0.4～1)μm×(1.0～2.0)μm的杆状。

2.1.2分离菌的生理生化特性

分离菌的生理生化鉴定结果见表1。由表1可见，该菌氧化酶、甘露醇和运动性试验为阳性，乳糖、水杨苷试验为阴性。生理生化特征与温和气单胞菌基本相同。

2.2感染试验

2.2.1注射感染

表2结果表明，hs-1对黄鳝有致病性，用3.0×106CFU /mL剂量攻击，黄鳝能长时间存活，只有少数表现为轻微出血；用3.0×107CFU /mL剂量攻击，黄鳝在3d死亡率达30%；其余黄鳝至试验结束除出现体表轻微出血，食量下降外均无明显症状。用3.0×108CFU /mL剂量攻击，黄鳝在3d死亡率为100%。试验中观察到，攻毒在24h内急性死亡的黄鳝除了在肝脏、肾脏中能分离到大量攻击菌外，发病症状并不明显，而在攻毒2d后发病的鱼才出现体表溃疡、腹腔大量腹水、肝脏变黑等典型自然发病症状。从病鳝肝脏、肾脏中分离到的致病菌与原分离菌株在菌落形态，生理生化特性方面基本相同。对照组无症状和无死亡。

表2　腹腔注射感染试验结果

2.2.2浸泡感染

由表3可见，浸泡感染试验中，创伤感染组比未创伤感染组死亡率明显高，且发病黄鳝出现的症状与自然发病症状也基本相似；对照组无症状、无死亡。分离菌株在人工浸泡试验中均表现出较强的致病力，能使健康黄鳝出现和自然病鳝相似的症状。试验中观察到，攻毒在24h内急性死亡的黄鳝除了在肝脏、肾脏中能分离到大量攻击菌外，发病症状并不明显，而在攻毒2d后发病的鱼才出现体表溃疡、腹腔大量腹水、肝脏变黑等典型自然发病症状。从病鳝肝脏、肾脏中分离到的致病菌与原分离菌株在菌落形态、生理生化特性方面基本相同。对照组无症状、无死亡。

表3　黄鳝浸泡感染试验结果

表4　分离菌株药敏试验结果

2.3药敏试验

分离菌株对15种药物的药敏试验结果表明：该病原菌对头孢曲松、氟哌酸、复方新诺明3种药物高度敏感；对氯霉素、新霉素、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、红霉素6种药物中度敏感；对氧氟沙星、氨苄西林、乙酰螺旋霉素、四环素、青霉素、强力霉素6种药物敏感低。各种药物对该菌株的抑菌圈数据见表4。

3讨论

1)本研究对典型患白头病的黄鳝进行病原菌的分离后，经过形态特征和生理生化特性分析，初步鉴定为温和气单胞菌。温和气单胞菌是一种条件致病菌，广泛分布在自然界中，主要致病因子是产生各种溶血毒素与肠毒素[3]。温和气单胞菌能引起多种动物发病，我国已从斑点叉尾鮰[4]、黄沙鳖[5]、黄颡鱼[9]和异域银鲫[3]等水生动物体内分离到此菌。在夏季高温季节，黄鳝苗种以水蚯蚓作为饵料时，可能由于水蚯蚓处理不干净，该菌由水蚯蚓带入而导致幼鳝发病[10]。预防时应做好饵料的消毒，防止病原菌的带入。

2)通过回归感染试验发现，hs-1具有较强的致病力。细菌浓度为3.0×106CFU/mL时，只对有外伤的黄鳝有感染力；当浓度达到3.0×107CFU/mL时，试验组均有感染，且浓度越高，发病越快，死亡率也越高；有创伤的黄鳝比无伤的黄鳝发病快，死亡率高；注射感染与浸泡感染无明显差异。由此可见，当机体抵抗力下降和病原菌大量繁殖时会引起黄鳝发病死亡。因此，在黄鳝放养前应对水体及网箱消毒，网箱提前浸泡，防止刮伤黄鳝体表；养殖过程中，应及时清除残饵，勤换水，保持良好的水质，管理好水草，规范操作，以免黄鳝受伤。

3)温和气单胞菌不同的分离株对药物的敏感性有差异。如苏应兵等[11]从出血病的斑点叉尾鮰中分离的温和气单胞菌对复方新诺明、四环素、氟哌酸和卡那霉素高度敏感，而对广谱抗生素氨苄青霉素、青霉素、先锋霉素Ⅵ和红霉素等均有耐药性。蔡完其等[12]从罗非鱼中分离出的温和气单胞菌对丁胺卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素B、妥布霉素、氟哌酸和氯霉素等抗生素敏感。马有智等[13]从背腹甲及四肢出现疖疮病、裙边糜烂的患病鳖的心、肝脏中分离到的温和气单胞菌对菌必治、头孢氨噻肟和头袍羧甲噻肟高度敏感，而对四环素、麦迪霉素、氨苄青霉素、青霉素、妥布霉素、万古霉素和洁霉素等不敏感。刘敏等[14]从患皮肤溃烂的鲤鱼皮肤病灶处和肝脏组织分离到温和气单胞菌对左氧氟沙星、氟哌酸、利福平、环丙沙星、白霉素高度敏感。

鱼的种类、鱼体的机能状况及环境因素都可能会影响细菌的毒力和表现，这可能是导致温和气单胞菌不同的分离株对药物有不同敏感性的原因。在实际生产中，药物种类的选择和剂量的确定还受到养殖环境、药物作用机理、药物使用频率、疾病严重程度等因素制约。本研究认为，从患白头病的黄鳝中分离到的温和气单胞菌对头抱曲松、氟哌酸、复方新诺明3种药物高度敏感；对氯霉素、新霉素、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、红霉素6种药物中度敏感；对氧氟沙星、氨苄西林、乙酰螺旋霉素、四环素、青霉素、强力霉素6种药物敏感程度低，可作为生产用药的参考。此外，黄鳝体表溃疡病与环境条件也有很大关系。因此，当该病发生后，在对该病经行药物治疗的同时，控制水质和环境都是十分重要的。

[参考文献]

[1]杨代勤.黄鳝疾病的诊断及防治[J].农家顾问，2005，(1)：55～56.

[2]胡琳琳，房文红，梁思成，等.金鱼温和气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J].上海水产大学学报，2008，17(3)：285～290.

[3]孙其涣，孙佩芳，金丽华，等.异育银鲫溶血性腹水病病原的研究[J].水产学报，1991，15(2)：130～139.

[4]谢旭阳.斑点叉尾鮰源温和气单胞菌生物学及药物敏感性研究[D].新乡：河南师范大学，2013.

[5]童桂香，韦信贤，黎小正，等.黄沙鳖温和气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J].广东农业科学，2010，(12)：124～126.

[6]陈晓燕，顾仲朝.一起副溶血性弧菌混合温和气单胞菌食物中毒的调查分析[J].浙江中医药大学学报，2006，30(3)：273～277.

[7]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京:科学出版社，1978：68～71，135～192.

[8]东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[9]陈铭.黄颡鱼温和气单胞菌的特性研究及溶血素基因的克隆与表达[D].重庆：西南大学，2009.

[10]徐海圣，舒妙安.黄鳝温和气单胞菌病病原的分离鉴定及免疫应答[J].中国兽医学报，2003，23(3)：240～242.

[11]苏应兵，邹桂伟，袁科平，等.斑点叉尾鮰暴发性败血症病原的分离与鉴定[J].淡水渔业，2006，36(5)：37～41.