Ca2+在顺铂诱导人卵巢癌SKOV3细胞自噬反应中的作用

曾林川，邓慧敏，陈 君，窦茗瀚，徐 冶.吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林 303；.吉林医药学院医学科研实验室，吉林 吉林 303



Ca2+在顺铂诱导人卵巢癌SKOV3细胞自噬反应中的作用

曾林川1，邓慧敏2，陈 君2，窦茗瀚2，徐 冶2
1.吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院医学科研实验室，吉林 吉林 132013

［摘要］背景与目的：Ca2+在维持细胞生物活性方面扮演着很重要的角色，其在细胞内的储存、释放和摄取主要受内质网调节，细胞内Ca2+浓度的稳态是维持细胞生物能量代谢、蛋白质折叠和分泌的基础条件。本研究探讨Ca2+在顺铂诱导SKOV3细胞内质网应激-自噬反应中的作用机制。方法：取人卵巢癌SKOV3细胞系为研究对象，按以下步骤分组：① 探讨顺铂诱导内质网应激与自噬反应，用6 μg/mL的顺铂处理SKOV3细胞0、6、12和24 h；② 了解顺铂和毒胡萝卜内酯（thapsigargin，TG）诱导内质网应激释放的Ca2+与自噬的关系，分别用TG和顺铂处理SKOV3细胞0、9和12 h；③ 探究Ca2+对自噬的作用机制，分成对照组、顺铂组、TG组、BAPTA-AM组、顺铂联合BAPTA-AM组和TG联合BAPTA-AM组。用蛋白［质］印迹法（Western blot）检测内质网应激相关蛋白GRP78和自噬标志性蛋白LC3蛋白的表达水平；用Fluo-4钙离子荧光探针检测细胞质中的Ca2+浓度变化；间接免疫荧光染色后，用共聚焦显微镜检测LC3蛋白的表达情况。结果：SKOV3细胞经6 μg/mL顺铂作用6 h时GRP78灰度值（1.393±0.004）与其对照组（0.679±0.011）相比显著提高（t=113.2，P=0.000），在12 h时LC3灰度值（0.072±0.002）与其对照组（0.038±0.000）相比显著提高（t=25.5，P=0.000）。间接免疫荧光结果显示，顺铂（6 μg/mL）组和TG（3 μmol/L）组随作用时间的延长，细胞内LC3荧光斑点会逐渐增多，并伴随着细胞质Ca2+浓度上升。后经钙离子络合剂BAPTA-AM干预后，细胞内LC3荧光强度进一步增强。Westren blot结果显示，顺铂组LC3灰度值（0.039±0.000）小于顺铂联合BAPTA-AM组（0.071±0.001），TG组（0.035±0.001）小于TG联合BAPTA-AM组（0.065±0.001），差异有统计学意义（P=0.000）。结论：顺铂诱导SKOV3细胞内质网应激和自噬的发生，并伴随着细胞质内Ca2+浓度的上升。络合细胞质内Ca2+能增强顺铂诱导的自噬反应。

［关键词］顺铂；Ca2+；内质网应激；自噬

Correspondence to：XU YeE-mail：xuye_9707@163.com

卵巢癌是临床上常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率高居女性最常见癌症的第3位，严重威胁女性的生命健康。由于卵巢癌早期没有具体的临床症状，再加上很多女性忽视了定期体检，造成绝大多数女性到卵巢癌晚期才被发现［1-2］。目前，卵巢癌在我国的死亡率高达3.13/10万［3］。临床上治疗卵巢癌的主要手段是化疗，顺铂是临床上治疗癌症的主要化疗药物之一，它的主要抗癌机制是抑制癌症细胞的DNA复制过程［4］。已有研究报道，顺铂在诱导卵巢癌细胞凋亡过程中促发了内质网应激和自噬，抑制自噬增加了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性［5］。

自噬是细胞吞噬自身蛋白质或细胞器并使之包被进入囊泡，最终与溶酶体融合降解其内容物的过程，自噬在细胞器的更新、体内蛋白质的平衡和细胞内环境的稳定方面发挥着主要的作用。同时，自噬也是程序性细胞死亡的一种形式。因此，自噬是细胞内的一把双刃剑，但自噬在细胞内的作用以前者为主［6］。最近，越来越多的文献表明，Ca2+在自噬发生过程中发挥重要的作用［7-8］。Ca2+是细胞的重要第二信使之一，在维持细胞代谢、增殖、分化和凋亡过程中发挥着重要的作用。细胞内的Ca2+浓度依赖于内质网中Ca2+的释放和细胞外Ca2+的摄入。内质网应激会诱导细胞内Ca2+浓度的增高和自噬的增强［9-10］。本文旨在探讨Ca2+在顺铂诱导卵巢癌细胞发生自噬中的作用。

1　材料和方法

1.1实验材料

本研究所用的人卵巢癌细胞株SKOV3购自中国科学院，RPMI 1640培养基和胎牛血清由Hyclone公司提供，BAPTA-AM、钙离子探针Fluo-4和顺铂均购自美国Sigma公司，LC3B抗体、GRP78抗体和β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司，PVDF膜（0.45 μm）购自Millipore公司。其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2细胞培养

人卵巢癌细胞株SKOV3用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）的RPMI 1640培养液培养，置于37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的培养箱中培养。每天换液1次，待细胞生长至对数生长期时，用0.25%胰酶进行消化，按1∶4比例进行传代，待细胞传至第3代后进行实验。实验分组：① 探讨顺铂诱导内质网应激与自噬的关系，按顺铂给药时间分成0、6、12和24 h 4组；② 观察顺铂和毒胡萝卜内酯（thapsigargin，TG）诱导内质网应激释放的Ca2+与自噬的关系，分别检测0、9和12 h 3个时间点；③ 探讨Ca2+对自噬的影响，实验分为对照组、顺铂组、TG组、BAPTA-AM组、顺铂联合BAPTA-AM组和TG联合BAPTA-AM组。每次实验重复3次。

1.3Fluo-4检测细胞质内Ca2+

将SKOV3细胞用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化，收集总细胞。计数后，按每孔5×104个细胞铺在24孔板内，放置在恒温培养箱中过夜。第2天，细胞长至80%密度，实验组分为顺铂（6 μg/mL）和TG（3 μmol/L）9、12 h两组和无药物作用的阴性对照组，每组设3个对照组。吸出每孔药物，并加入D-Hanks液洗3次，然后各加入稀释后的Fluo-4（5 μmol/L）。30 min后用D-Hanks液洗3次，处理完后在激光扫描共聚焦显微镜下观察并取图分析。

1.4间接免疫荧光法检测自噬标志性蛋白LC3

高压消毒后无菌盖玻片置于24孔板中，取细胞密度1×105/mL，每孔500 μL接种过夜，第2天，细胞长至80%密度，实验组分别用顺铂6 μg /mL处理9、12 h，同时设置未加顺铂的阴性对照组。弃去培养基，加入200 μL固定液（4%多聚甲醛）作用10 min，吸去固定液加0.01 mol/L 的PBS洗涤后，爬片固定后经0.1%的PBS-Triton作用5 min，用0.01mol/L的PBS洗涤，非免疫山羊血清封闭30 min，加入预混的一抗4 ℃过夜，用0.01mol/L的PBS洗涤，加入预混的荧光二抗Alexa Fluor 488抗兔的IgG抗体作用30 min，用0.01 mol/L的PBS洗涤，抗荧光淬灭剂封片，用激光共聚焦显微镜观察并取图分析。

1.5蛋白［质］印迹法（Western blot）检测

通过Western blot检测人卵巢癌SKOV3细胞中内质网应激和自噬反应中相关蛋白的表达。提取细胞总蛋白，不同的药物处理后，经消化收集到离心管中，175×g离心取上清液转移到1.5 mL离心管中，进一步混匀，4 ℃，900×g再次离心。吸净上清液，每管加入200～300 μL 的RIPA蛋白裂解液（含1%PMSF），超声5 s左右打碎基因组后4 ℃放置45 min（以上全程冰上操作）。Bradford法测蛋白浓度，-20 ℃备用。取待测样本按30～60 μg上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳常规电泳、半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭、一抗4 ℃过夜，二抗温育2 h，用0.01 mol/L的PBS洗膜3次，1次15 min，2次5 min，加ECL显色液进行显影结果。数据采用天能图像分析系统以及Quantity One软件进行分析。

1.6统计学处理

2　结果

2.1顺铂诱导SKOV3细胞内GRP78表达和LC3的活化

用顺铂6 μg/mL处理SKOV3细胞0、6、12和24 h。Western blot检测结果表明，顺铂能够诱导SKOV3细胞GRP78和LC3高表达，且GRP78表达增强早于LC3，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

2.2顺铂诱导SKOV3细胞细胞质内Ca2+水平的增加和LC3的活化

根据上述实验结果，用共聚焦显微镜观察细胞质中Fluo-4所标记的Ca2+荧光，通过间接免疫荧光法检测自噬标记蛋白LC3。结果显示，TG和顺铂处理9 h后，SKOV3细胞内荧光强度增强，表明细胞质中的Ca2+水平增加；与此同时，LC3荧光结果显示，细胞质中出现荧光斑点，说明顺铂和TG在诱导自噬的活化过程中，可能与细胞质中Ca2+浓度变化有关（图2）。2.3BAPTA-AM增强顺铂和TG所诱导LC3的表达免疫荧光结果显示，10 μmol/L BAPTA-AM作用于SKOV3细胞后出现LC3荧光小斑点。分别用6 μg/mL顺铂和3 μmol/L TG联合钙离子络合剂BAPTA-AM时，LC3的绿色荧光要明显强于各自的单独作用组（图3）。此外，采用Western blot对顺铂和TG的单独作用组及各自联合钙离子络合剂后的LC3蛋白表达结果进行验证，结果显示，LC3的蛋白表达情况与LC3免疫荧光结果一致，差异有统计学意义（P＜0.05，图4）。

图1　Western blot检测顺铂对SKOV3细胞GRP78、LC3蛋白表达的影响Fig. 1　　Western blot detection of the expression of GRP78 and LC3 in SKOV3 cells treated with 6 μg/mL cisplatin

图2　共聚焦显微镜观察顺铂和TG处理不同时间后SKOV3细胞细胞质中Ca2+浓度变化和LC3蛋白的表达Fig. 2　　Observation of the distribution of Ca2+and LC3 in the cytoplasm of SKOV3 cells treated with 6 μg/mL cisplatin or 3 μmol/L TG for 0，9，and 12 h by confocal microscopy

图3　免疫荧光染色检测顺铂、TG、BAPTA-AM及联合用药组中LC3蛋白的表达情况Fig. 3　　Immunofuorescence staining for the LC3 expressions in SKOV3 cells treated with cisplatin，TG and/or BAPTA-AM

（×1 200）

图4　Western blot检测顺铂、TG、BAPTA-AM以及联合用药组中LC3蛋白的表达情况Fig. 4　　Western blot analysis for the protein expressions of LC3Ⅱ/LC3Ⅰin SKOV3 cells treated with cisplatin，TG and/or BAPTA-AM

3　讨论

内质网应激与自噬之间复杂的调控机制，具有促进细胞存活和死亡的双向选择效应［11-12］。通过揭秘内质网应激与自噬复杂网络，有可能提高化疗药物的治疗效果和克服肿瘤的耐药性［13-14］。GRP78作为一种内质网伴侣蛋白，在内质网应激状态下会高表达，被视为内质网应激反应的标志性蛋白［15］。细胞发生自噬时，参与自噬体形成的LC3蛋白活化，由LC3-Ⅰ转化为脂质化的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值的多少在某种程度上反映了细胞的自噬活性［16］。本实验结果显示，顺铂作用SKOV3细胞6 h时，GRP78蛋白就已经明显上调，然而，LC3蛋白的表达发生12 h左右。这说明顺铂能诱导SKOV3细胞发生内质网应激和自噬反应，且自噬的发生可能是内质网应激所介导的下游效应。

已有研究表明，刺激内质网内的Ca2+进入细胞质会促发自噬反应的活化［17-18］，如维生素D3、离子霉素和三磷酸腺苷，TG诱导细胞中的Ca2+水平升高，通过激活Ca2+/钙调蛋白依赖激酶β使下游AMPK兴奋而诱导自噬。也有研究显示，Ca2+进入细胞质具有抑制自噬活化的作用［19］，如Xestospongin B/siRNA阻滞剂，抑制内质网的Ca2+释放通道1，4，5-三磷酸肌醇受体后，会促发自噬。L型钙通道阻滞剂通过抑制钙蛋白酶活性也能诱导自噬。以上资料表明，钙信号对自噬活化起着重要的调节作用，但是具体的作用机制一直存在争议。这可能是由于探究的肿瘤细胞种类不同及技术条件限制，导致很多机制都未被阐明所引起的。随着对细胞内钙信号检测手段的完善，我们选择目前灵敏度较高的Fluo-4作为钙离子探针，检测细胞质中的Ca2+浓度的变化，运用国际公认的标准Ca2+络合工具药BAPTA-AM，探究顺铂诱导SKOV3内质网应激介导的自噬反应与细胞质中的Ca2+浓度波动的关系，并以TG作为内质网应激模型组。实验结果表明，单独顺铂或TG可以诱导SKOV3发生自噬，在联合钙离子络合剂BAPTA-AM后，自噬标志性蛋白LC3的表达明显上调。这说明缓冲顺铂和TG所诱导的细胞质中的Ca2+上升后，能够增强其下游的自噬反应。这一过程可能与溶酶体的功能有关，由于络合细胞质中的Ca2+，使得溶酶体对自噬体的降解被抑制，从而抑制了自噬的降解［20］。也有可能是由于络合了细胞质中的Ca2+，使得进入线粒体内的Ca2+减少，导致通过线粒体内呼吸链的电子流减少，三磷酸腺苷生成被抑制，激活下游AMPK途径诱导的自噬反应等［21］。

综上所述，顺铂能诱导SKOV3细胞发生内质网应激和自噬反应，并伴随着细胞质中的Ca2+浓度上升，络合细胞质中的Ca2+，增强其下游自噬反应的强度，说明细胞质中的Ca2+对自噬的发生具有抑制效应。这一结果有助于进一步探索Ca2+对自噬的调节机制，为肿瘤的治疗及药物开发提供新的思路。

［参 考 文 献］

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The effect of cytoplasmic Ca2+on cisplatin-induced autophagy in ovarian carcinoma SKOV3 cells and its mechanism

ZENG Linchuan1，DENG Huimin2，CHEN Jun2，DOU Minghan2，XU Ye2（1.School of Public Health，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin Province，China；2.Medical Research Laboratory，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin Province，China）

［Key words］Cisplatin；Ca2+；ER Stress；Autophagy

［Abstract］Background and purpose：Ca2+plays a very important role in the maintenance of cell biological functions. The storage，release and uptake capacity of Ca2+is controlled by endoplasmic reticulum （ER）. Ca2+homeostasis is essential for cellular energy metabolism and proper protein folding. This study aimed to investigate the effect of cytoplasmic Ca2+on cisplatin induced ER stress-mediated autophagy in ovarian carcinoma SKOV3 and its underlying mechanism. Methods：The ovarian cancer SKOV3 was used as a study object. The experiment consisted of three parts：① To explore the possible relationship between cisplatin-induced ER stress and autophagy，SKOV3 cells were treated with cisplatin for 0，6，12 and 24 h，respectively；② To explore the possible relationship between ER stress induced Ca2+efux and autophagy，SKOV3 cells were treated with cisplatin for 0，9 and 12 h，respectively，and TG was used asa positive control；③ To explore the effects of blocking calcium efux on autophagy，SKOV3 cells were divided into control group，cisplatin group，TG group，BAPTA-AM group，cisplatin combined with BAPTA-AM group and TG combined with BAPTA-AM group. Western blot was used to detect the protein levels of GRP78 and LC3. Fluo-4 calcium fluorescent probe was used to examine cytoplasmic Ca2+levels. Confocal microscopy was used to detect LC3 level by immunoflurescence staining. Results：Compared to control group （0.679±0.011），GRP78 was significantly accumulated at 6，12 and 24 h after cisplatin treatment and reached the maximum value at 6 h （1.393±0.004，P=0.000）. Similarly，compared to control group （0.038±0.000），LC3 puncta were clearly seen after cisplatin treatment and reached the maximum value at 12 h （0.072±0.002，P=0.000）. Using confocal microscopy，we found that cisplatin and TG increased LC3 punctate accumulation and cytoplasmic Ca2+levels in a time-dependent manner. Immunofluorescent method showed that treatment with cisplatin combined with BAPTA-AM or TG combined with BAPTA-AM increased LC3 punctate accumulation induced by cisplatin or TG. The results of Western blot showed that cisplatin combined with BAPTA-AM （0.071±0.001） or TG combined with BAPTA-AM （0.065±0.001） significantly increased LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio induced by cisplatin （0.039±0.000，P=0.000） or TG （0.035±0.001，P=0.000）. Conclusion：Cisplatin induces intracellular ER stress and autophagy in SKOV3 cells，accompanied by increased cytoplasmic Ca2+levels. Chelating cytoplasmic Ca2+enhances cisplatin-induced autophagy.

DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.04.005

中图分类号：R737.31

文献标志码：A

文章编号：1007-3639（2016）04-0313-07

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81372793）；吉林省教育厅十三五科技项目（2016237）；2014吉林省大学生创新创业项目（2014001）。

通信作者：徐 冶 E-mail：xuye_9707@163.com

收稿日期：（2015-04-24修回日期：2015-06-07）