沃尼妙林对脂多糖诱导的RAW264.7细胞TLR4和CD14表达的影响

武智勇，刘思岐，齐炳尧，宋广萍，王春丽，陈志宝（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163319）



沃尼妙林对脂多糖诱导的RAW264.7细胞TLR4和CD14表达的影响

武智勇，刘思岐，齐炳尧，宋广萍，王春丽，陈志宝
（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163319）

摘要：探讨沃尼妙林对脂多糖诱导的RAW264.7细胞TLR4和CD14表达的影响。通过Real-Time PCR和Western Blot检测细胞TLR4和CD14的表达情况，发现脂多糖刺激RAW264.7细胞后，可导致TLR4和CD14表达的增高；不同浓度的沃尼妙林预处理能够抑制脂多糖诱导的TLR4和CD14的表达，并且呈剂量依赖性。结果表明，沃尼妙林具有抗炎作用，可以明显改善LPS诱导的急性肺损伤。

关键词：沃尼妙林；脂多糖类；巨噬细胞；TLR4；CD14

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌外壁上的主要成分，可与细胞表面及血浆中的受体相结合[1-2]。CD14是最早被发现与LPS结合最重要、亲和力最高的受体[3]。这种受体与LPS结合后，形成CD14-LPS-LBP的三联复合体，进而活化TLR4的信号传导[4]。TLR4在机体抗感染的免疫炎症反应中扮演着重要角色，是LPS信号向细胞内传导的“门户蛋白”，由于CD14是通过糖基磷脂酰肌醇锚固在细胞膜上，缺乏跨膜结构，需要通过TLR4将LPS的信号从细胞外传递到细胞内[5]。两者协同作用激活炎性细胞，合成和释放多种细胞因子，引起全身炎症反应综合征，多器官功能衰竭，甚至死亡[6-7]。

沃尼妙林是新一代广谱的截短侧耳素类半合成抗生素，对革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、支原体以及螺旋体均有效[8]。据报道，沃尼妙林对肠道疾病、急性多关节炎、地方性肺炎等有较好的治疗效果[9]。同时，沃尼妙林通过降低单核细胞、巨噬细胞等分泌和释放TNF-α，IL-6等炎性相关因子，可以有效保护LPS诱导的急性肺损伤[10]。但是，很少有通过研究沃尼妙林与LPS、TLR4、CD14的关系，来探索其抑制致炎症细胞因子的分泌，从而改善LPS诱导急性肺损伤的报道[11-13]。实验从分子水平和蛋白水平研究沃尼妙林对LPS上游信号转导载体TLR4和CD14表达的影响，进而探索沃尼妙林有效保护LPS诱导的急性肺损伤的作用机制。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

沃尼妙林（Sigma，美国）；脂多糖（Sigma，美国）；DMEM/高糖培养基（Hyclone，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；BCA蛋白定量试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒、逆转录试剂盒（Thermo，美国）；Trizol（Invitrogen，美国）；引物（TLR4、CD14、GAPDH）（捷瑞，上海）；抗体TLR4、CD14（Abcam，英国）；抗体GAPDH （CST，美国）；羊抗兔HRP标记二抗、羊抗鼠HRP标记二抗（碧云天，上海）。

1.2实验分组

按以下分组进行实验：

（1）LPS诱导RAW264.7细胞TLR4和CD14的mRNA和蛋白表达的时间效应。

实验分为空白对照组和LPS组，其中LPS终浓度为1 μg·mL-1，并且分别在3、6、12、24、48 h终止培养，提取细胞总RNA和蛋白质[14-15]。

（2）沃尼妙林对LPS诱导RAW 264.7细胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表达的影响。

实验分为4组：①空白对照组；②LPS组：LPS终浓度为1 μg·mL-1；③LPS+沃尼妙林组：给予终浓度为10 μg·mL-1的沃尼妙林孵育1 h，再加入1 μg·mL-1LPS刺激；④沃尼妙林组：给予终浓度为10 μg·mL-1的沃尼妙林孵育1 h。培养RAW264.7细胞48 h，分别提取细胞总RNA和蛋白质。

（3）不同浓度的沃尼妙林对LPS诱导RAW 264.7细胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表达的影响。

实验分为5组：①空白对照组；②LPS组：LPS终浓度为1 μg·mL-1；③④⑤LPS+沃尼妙林组：LPS终浓度为1 μg·mL-1，给予终浓度分别为5 μg·mL-1（低剂量组）、10 μg·mL-1（中剂量组）和25 μg·mL-1（高剂量组）的沃尼妙林进行预处理。沃尼妙林孵育1 h后，再加入1 μg·mL-1LPS刺激，培养RAW264.7细胞48 h，分别提取细胞总RNA和蛋白质。

1.3方法

1.3.1小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养

小鼠巨噬细胞RAW264.7由本室保存。参考李岩等[16]报道的RAW264.7细胞培养方法进行培养，用DMEM培养基（含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素）5%CO2、37℃条件下传代培养。

1.3.2Real-Time PCR检测RAW264.7细胞TLR4和CD14 mRNA的表达

各组细胞加入相应刺激物后继续培养48 h，用Trizol法提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒逆转录总RNA至cDNA，特异性引物对制备好的cDNA进行扩增，按以下程序进行PCR反应：95℃变性10 min；95℃15 s，60℃45 s，共40个循环。使用ABI Prism 7 300 SDS Software进行分析。引物序列由上海捷瑞生物公司合成，序列见表1。

表1　引物序列Table 1Sequences of primers

1.3.3Western Blot检测RAW 264.7细胞TLR4和

CD14蛋白的表达

各组细胞加入相应刺激物后继续培养48 h，使用预冷的PBS洗净残留培养液，用细胞刮子将细胞刮下并加入细胞裂解液裂解细胞30 min，5 000 r·min-1离心洗涤细胞2次，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。根据蛋白定量结果使用SDS上样缓冲液进行调样，沸水浴10 min后离心取上清上样。进行SDSPAGE电泳（5%的浓缩胶和10%的分离胶），转膜，5%的脱脂奶粉37℃封闭1 h，加抗CD14、TLR4或GAPDH单克隆抗体，4℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液37℃孵育1 h，ECL法显影，分析条带灰度值，以目的条带与GAPDH条带的灰度比值来表示TLR4和CD14蛋白相对表达量。

1.3.4统计学处理

应用Graphpad prism 5进行单因素方差分析（One-way ANOVA），T检验及各组差异分析，以P<0.05表示有统计学意义。

2　结果

2.1LPS诱导RAW264.7细胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表达的时间效应

LPS诱导RAW264.7细胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表达的时间效应见图1和图2。未受LPS刺激的RAW264.7细胞有少量的TLR4和CD14 mRNA的表达。LPS组（12 h）TLR4 mRNA（P<0.01）和CD14 mRNA（P<0.05）的表达与空白组相比开始具有统计学差异，并且表达量随着时间的增加而上升。LPS组（24 h）和LPS组（48 h）TLR4和CD14 mRNA的表达与空白组相比差异极其明显（P<0.001）。

图1　LPS诱导RAW264.7细胞TLR4和CD14 mRNA表达的时间效应Fig.1Effects of variable time on expression of TLR4 and CD14 mRNA in LPS induced RAW264.7 cells

图2　LPS诱导RAW264.7细胞TLR4和CD14蛋白表达的时间效应Fig.2Effects of variable time on expression of TLR4 and CD14 protein in LPS induced RAW 264.7 cells

同样，Western Blot结果显示在无外源性刺激的情况下，RAW 264.7细胞TLR4和CD14蛋白表达极低，LPS可以上调RAW264.7细胞TLR4和CD14蛋白的表达，并且表达量随着时间的增加而递增。

2.2沃尼妙林对LPS诱导RAW264.7细胞TLR4 和CD14 mRNA和蛋白表达的影响

Real-Time PCR结果显示，在无外源性刺激的情况下，RAW264.7细胞TLR4和CD14 mRNA表达极低，单独加入沃尼妙林对其表达无显著影响。LPS可以极其显著地上调RAW 264.7细胞TLR4和CD14 mRNA的表达（P<0.001）；而在LPS刺激前加入沃尼妙林进行预处理，可以抑制脂多糖诱导的TLR4 mRNA （P<0.05）和CD14 mRNA（P<0.01）的表达（见图3）。

图3　沃尼妙林对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4和CD14 mRNA表达的影响Fig.3Effects of valnemulin on expression of TLR4 and CD14 mRNA in LPS induced RAW264.7 cells

Western Blot结果显示，LPS能上调TLR4和CD14蛋白表达，而通过沃尼妙林预处理能降低LPS诱导的TLR4和CD14蛋白表达（见图4）。

图4　沃尼妙林对LPS诱导RAW264.7细胞TLR4和CD14蛋白表达的影响Fig.4Effects of Val on expression of TLR4 and CD14 protein in LPS induced RAW 264.7 cells

2.3不同浓度沃尼妙林对LPS诱导RAW264.7细

胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表达的影响

LPS刺激RAW264.7细胞前给予不同浓度的沃尼妙林进行预处理，各剂量组均能极显著降低TLR4 和CD14 mRNA的表达（P<0.001），并且呈现剂量依赖性（见图5）。

图5　不同浓度的沃尼妙林对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4和CD14 mRNA表达的影响Fig.5Effects of variable concentrations of valnemulin on expression of TLR4 and CD14 mRNA in LPS induced RAW264.7 cells

Western Blot结果显示，LPS刺激前不同浓度沃尼妙林进行预处理，能够降低LPS诱导的TLR4和CD14蛋白表达，并且抑制作用随着沃尼妙林浓度的递增而增强（见图6）。

图6　不同浓度的沃尼妙林对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4和CD14蛋白表达的影响Fig.6　Effects of variable concentration of Val on expression of TLR4 and CD14 protein in LPS induced RAW264.7 cells

3　讨论

急性肺损伤是由严重感染、休克、创伤等因素引起的以炎症反应和肺泡毛细血管损伤为主要病理改变，临床表现为进行性的呼吸困难和顽固性低氧血症，死亡率较高，严重危害人类的健康[17]。内毒素是首要致病因素，LPS是内毒素的主要成分，它与细胞结合后，通过LPS-LBP-CD14三联复合物作用于TLR4，刺激中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等，激活细胞内的NF-κB和MAPKs信号通路，诱导细胞产生并释放大量的细胞因子和炎性介质，如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、NO等，导致急性肺损伤的发生[18-19]。研究显示，乌司他丁和地塞米松对LPS诱导急性肺损伤具有保护作用，均可以通过抑制TNF-α、IL-6等炎症因子的释放，最终达到阻止炎症反应带来的损伤[20-21]。研究报道，在LPS所致的小鼠急性肺损伤模型中，预服用沃尼妙林可以显著抑制NF-κB的活力，抑制炎性细胞因子TNF-α，IL-6等的分泌，提高抗炎因子IL-10的水平，有效保护LPS诱导的急性肺损伤[22]。

激发细胞内多种信号传导的第一步是宿主受体识别LPS，并通过CD14和TLR4激活LPS内在免疫信号转导途径进而激活NF-kB，而转录因子NF-kB的活化是炎症反应的共同途径。因此，研究从阻断病理性信号传入入手，以LPS上游信号通路TLR4和CD14为研究对象，研究发现LPS可以使TLR4和CD14 mRNA和蛋白的表达量明显增强。在LPS刺激前对RAW264.7细胞进行沃尼妙林预处理，可以显著降低TLR4和CD14 mRNA和蛋白的表达量。不同浓度的沃尼妙林处理LPS诱导的RAW264.7细胞，结果显示沃尼妙林显著抑制了LPS诱导RAW264.7细胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白的表达，并且抑制作用呈现剂量依赖性。

综上所述，沃尼妙林可以通过调控炎性相关因子和炎性介质的影响而起到有效保护LPS诱导急性肺损伤的作用，可能是由于沃尼妙林有效抑制了LPS信号通路的上游受体TLR4和CD14的表达，抑制LPS对单核巨噬细胞的活化而导致的。这是对沃尼妙林的抗炎作用及对炎症信号转导通路调控机制的进一步补充，对于临床上预防和治疗急性肺损伤具有重要意义。

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Effects of Valnemulin on LR4 and CD14 Expression in Lipopolysaccharide-treated RAW264.7 Cells

Wu Zhiyong，Liu Siqi，Qi Bingyao，Song Guangping，Wang Chunli，Chen Zhibao
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Abstract:To explore the effect of valnemulin（Val）in this process which LPS induces TLR4 and CD14 expression in RAW264.7 cells.The expression of CD14 and TLR4 was detected by Real-Time PCR and Western Blot cell.After the discovery that LPS stimulated RAW264.7 cells，it might lead to increase TLR4 and CD14 expression.The different concentrations of valnemulin could reduce LPS-induced TL4 and CD14 expression in dose-dependent manner of mRNA and protein levels.The results showed that valnemulin had anti-inflammatory properties on LPS-induced acute lung injury，and could significantly improve the LPS-induced acute lung injury.

Key words：valnemulin;LPS;macrophage cells;TLR4;CD14

中图分类号：R392

文献标识码：A

文章编号：1002-2090（2016）01-0059-05

doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2016.01.013

收稿日期：2014-12-10

基金项目：校内博士启动基金（XDB2012-14）。

作者简介：武智勇（1989-），男，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院2012级硕士研究生。

通讯作者：陈志宝，男，教授，博士研究生导师，E-mail：chenzhibao_2000@sina.com。