发酵法脱腥对豪猪肝挥发性风味的影响
2016-06-07于学萍童群义
于学萍，童群义
(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)
发酵法脱腥对豪猪肝挥发性风味的影响
于学萍，童群义*
(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)
摘要采用顶空固相微萃取和气质联用技术(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)，分析了豪猪肝的挥发性风味成分，采用酵母对豪猪肝进行发酵脱腥处理，以感官评分和电子舌主成分分析为评价指标，通过正交实验优化了发酵脱腥工艺条件，并对发酵前后的风味成分进行比较。优化得到酵母发酵脱腥工艺条件：酵母的添加量为1.2%，发酵温度为35 ℃，发酵时间为45 min。GC-MS分析结果表明，发酵后，豪猪肝的醛类、酮类等主要挥发性风味物质的种类和含量均大幅度减小，其中主要呈味物质正己醛、2-辛烯醛、2-庚烯醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和2-正戊基呋喃的含量也不同程度地减小，所以酵母发酵法能较好地减少或去除豪猪肝的腥味物质。
关键词豪猪肝；发酵；脱腥；风味
豪猪，又称箭猪、刺猪，在动物分类学上属于哺乳纲、啮齿目、豪猪科,是一种经济价值很高的动物，不仅具有较高的食用价值，还具有较高的药用价值。如今我国豪猪饲养厂日益增多，但生产加工豪猪肉的同时产生了大量的副产物，如肝、肚、刺等，不仅造成了资源的浪费，也造成了环境污染。豪猪肝是豪猪屠宰后的主要副产物之一，虽营养丰富，但腥味较重，如何去除豪猪肝的腥味是一个难题。
目前，关于肝异味及肝腥味物质的研究较少，IM等[1]研究发现，猪肝的异味主要来自挥发性的醛类、醇类等物质，其中2,4-庚二烯醛对猪肝的肝腥味贡献最大。如今脱除腥味的方法有很多，从作用机理来看，主要有物理脱腥法、化学脱腥法和生物脱腥法等。化学脱腥法容易产生化学物质残留，有一定的食品安全问题；物理脱腥法和生物脱腥法均没有在产品中引入合成的化学物质，消费者较容易接受，但是物理脱腥方法的效果不是很理想。生物脱腥法是利用微生物发酵技术除去腥味成分和异味的方法，是一种绿色有发展前景的脱腥方法[2]，选用的发酵微生物有酵母菌、乳酸菌、醋酸杆菌等。酵母发酵法是在生物脱腥法中比较常用的，其脱腥机理较为复杂：酵母的疏松结构对腥臭物质具有一定的吸附作用；酵母体内含有的醇脱氢酶、醛脱氢酶能将醛类以及烯醛类等腥味物质氧化或还原为风味较柔和的醇和酸。酵母发酵法能有效地去减少水产品的腥味物质，武力刚等[3]利用酵母粉对虾头和虾壳蛋白水解液进行脱腥，发现随着酵母粉的添加，三甲胺含量减小，腥味减弱。但是，关于酵母发酵法对动物肝脏的挥发性风味的改善尚没有报道。本文采用顶空固相微萃取和气质联用技术(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)，测定了豪猪肝的风味成分，同时采用酵母进行脱腥，比较发酵法脱腥对豪猪肝挥发性风味的影响，为豪猪肝产品的深加工与利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与设备
豪猪肝，常德市豪乡食品有限公司；活性干酵母，安琪酵母股份有限公司。
T18基本型分散机，德国IKA公司；AB 104-N电子称，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司；C21-RT2110电磁炉，广州美的生活电器制造有限公司；DS-200高速组织捣碎机，江苏江阴科研器械厂；EL20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；电子舌，上海瑞玢国际贸易公司；Trace MS气相色谱质谱联用仪，美国Finnigan质谱公司。
1.2实验方法
1.2.1豪猪肝前处理
将豪猪肝洗净，95 ℃下热烫2～3 min，去除腺管、筋等，浸泡冲洗去除豪猪血等杂质，将豪猪肝切碎，豪猪肝与冰水按照1∶1的质量比打浆。
1.2.2发酵法脱腥的单因素实验
以腥味值和主成分分析为指标，考察酵母添加量(%)、发酵时间(s)和发酵温度(℃)3个因素对提取效果的影响，以确定后续正交实验各因素水平。
1.2.2.1酵母添加量
在6个烧杯中称取相同质量的豪猪肝浆，分别加入质量分数为0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%，2.4%的酵母，置于35 ℃水浴锅中，发酵60 min，进行感官评定和电子舌检测。
1.2.2.2作用时间
在6个烧杯中称取相同质量的豪猪肝浆，都加入1.4%的酵母，置于35 ℃水浴锅中，分别发酵15，30，45，60，75，90 min，进行感官评定和电子舌检测。
1.2.2.3发酵温度
在6个烧杯中称取相同质量的豪猪肝浆，加入1.4%的酵母，分别置于25，30，35，40，45，50 ℃水浴锅中，发酵60 min后取出，进行感官评定和电子舌检测。
1.2.3发酵法脱腥工艺优化
根据单因素实验结果，以酵母添加量、温度和时间为因素，设计3因素3水平正交实验，进一步优化发酵法脱腥的工艺参数。实验因素水平见表1。
表1 正交因素水平设计表
1.2.4腥味感官评价
因脱腥效果无法作定量测定，实验中以5位感官评价员的感官评定的结果表示脱腥效果，并将腥味程度分成8个等级，以双蒸水作为参照(分值为0分)，分类级别及对应分值为0——无腥味；1——略有腥味；2——腥味较弱；3——有腥味；4——腥味一般；5——腥味偏重；6——腥味较重；7——腥味很重。分值越大，则腥味越重。感官评价值为5人评定小组的平均得分。
1.2.5电子舌分析
电子舌包含6个工作电极(铂电极、金电极、钯电极、钛电极、钨电极和镍电极)的传感器阵列，以铂柱电极为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，使工作电极逐个对溶液进行多频大幅脉冲伏安法扫描。电子舌扫描参数：正向最大多频大幅脉冲电位1.0 V，负向多频大幅脉冲电位-1.0 V，递减脉冲幅度为0.2 V，频率段为1、10和100 Hz，脉冲间隔为0.001 s。数据采集前，检测头清洗时间2～3 min，采用0 V稳定2.6 s，1.2 V稳定2.6 s，-1.2 V稳定2.6 s，以确保采集的数据具有可靠性和稳定性[4-5]。
实验前对样品进行预处理，取2 g样品加入23 mL蒸馏水，搅拌均匀后直接倒入电子舌专用烧杯中(每杯样品量体积为25 mL)检测。本实验采用蒸馏水作为清洗溶剂，采样时间为180 s，样品测量后清洗时间为120～180 s，样品数据每隔l s采集1次数据，取测量值的平均值作为每个样本1次测量的数据。为减少测量误差，每个样品平行测定3次，每个平行重复测量7次，取后3次测量的各传感器平均值作为1个样本数据进行后续数据分析。
1.2.6顶空固相微萃取
取3 g左右样品置于15 mL顶空瓶中，将老化后的75 μm Car/PDMS萃取头插入样品瓶顶空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。
1.2.7气相色谱-质谱(GC-MS)
GC条件：毛细管柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为He，流速0.9 mL/min，进样口温度为250℃，不分流；程序升温初始温度为40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持7 min。
MS条件：离子化方式EI，电子能量70 eV，发射电流80 μA，接口温度250 ℃，离子源温度200 ℃，检测电压1 000 V，质量扫描范围33～450 m/z。用NISTDEMO，REPLIB，WILLEY，MAINLIB4个标准谱库对化合物检索结果进行匹配，相似指数(SI)为800(最大值1 000)以上的确认为化合物。豪猪肝中主要挥发性成分的相对百分比采用峰面积归一化法计算。
1.2.8数据处理
采用Orogin8.5及SPSS11.5数据分析软件对数据进行处理，运用Duncan检验进行显著性分析(P<0.05)。电子舌数据的主成分分析由电子舌自带软件完成。
2结果与讨论
2.1发酵法脱腥单因素和正交实验结果
2.1.1酵母添加量对发酵法脱腥的影响
从图1(a)可以看出，酵母添加量增大时，腥味值先减小后增大，当添加量在1.6%～2.4%的时候，腥味值改变不大，反倒带来酒糟味。酵母添加量的主成分分析图如图1(b)所示，主成分1和主成分2保持了原始数据98.0%的信息量，并且主要信息集中在主成分1上。主成分1和主成分2对不同酵母添加量的豪猪肝样品有很好地区分，不同脱腥效果的豪猪肝都很好地落在各自的区域内，互不重叠且各区域内点的离散度比较小。添加1.2%和1.6%的酵母粉对豪猪肝的电子舌的主成分分析的影响不大，而且1.6%的酵母粉会带来一定的酒糟味，综合经济效益的考虑，选择酵母添加量在0.8%～1.2%较适合。
(a)感官评价腥味值；(b)电子舌主成分分析图图1 酵母添加量对发酵法脱腥的影响Fig.1 Effect of yeast addition on the fermentation deodorization method
2.1.2发酵时间对发酵法脱腥效果的影响
从图2(a)可以看出，随着时间的增长，腥味值先减小后增大，在45 min的时候最小。酵母作用时间的主成分分析图如图2(b)所示，主成分1和主成分2保持了原始数据82.1%的信息量，并且主要信息集中在主成分1上，由图(2)可知，主成分1和主成分2对不同酵母发酵时间的豪猪肝样品有很好的区分，不同脱腥效果的豪猪肝都很好地落在各自的区域内，互不重叠且各区域内点的离散度比较小。同时由图2(b)可知，发酵时间为45 min和60 min的豪猪肝酱区别不明显，发酵时间为45～60 min较适合。
(a)感官评价腥味值；(b)电子舌主成分分析图图2 发酵时间对发酵法脱腥的影响Fig.2 Effect of time on the fermentation deodorization method
2.1.3发酵温度对发酵法脱腥效果的影响
从图3(a)可以看出，酵母发酵的温度对腥味值的影响明显，温度增高，腥味值反倒变大，不愉快的发酵味也比较浓郁，故发酵温度可选择在35 ℃左右。不同酵母作用温度的主成分分析如图3(b)所示，主成分1和主成分2保持了原始数据73.6%的信息量，并且主要信息集中在主成分1上，主成分1和主成分2对不同酵母脱腥温度的豪猪肝样品有很好的区分，不同脱腥效果的豪猪肝都很好地落在各自的区域内，互不重叠且各区域内点的离散度比较小。从主成分分析图可知，30，35和40 ℃下脱腥的豪猪肝无明显差异，所以发酵温度30～40 ℃较为合适。
(a)感官评价腥味值；(b)电子舌主成分分析图图3 发酵温度对发酵法脱腥的影响Fig.3 Effect of temperature on the fermentation deodorization method
2.1.4发酵法正交实验设计与结果
从极差分析表明，影响腥味值的主次顺序因素是C>A>B，即酵母发酵的温度>酵母的添加量>发酵的时间，最佳方案是A3B2C2。从方差分析表可以看出，因素C显著(0.01
根据选择的最佳脱腥条件A3B2C2进行实验，进行感官评定计算腥味值，验证最佳实验条件，实验重复3次。在该实验条件下，腥味值为2.0，符合正交实验的结果(表2、表3)，因此选择的最佳脱腥工艺可行。
表2 正交实验结果与分析
表3 正交实验方差分析表
注：*表示差异显著(P<0.05)。
2.2发酵法脱腥对豪猪肝风味的影响
顶空固相微萃取技术能有效地吸附豪猪肝中的挥发性成分，经过质谱数据库检索，共检出53种成分。检出物质的相对分子质量范围大部分处于70～228。在检出的53种成分中，大多是一些含有羰基的饱和或不饱和的醛类、酮类、酯类、醇类和酸类。其中醇类12种、酮类11种、烃类10种、醛类9种、酸类6种、酯类3种、呋喃2种，其总含量高达88.15%。豪猪肝发酵法脱腥后，共检测出57种成分，其中醇类18种、酮类6种、烃类3种、醛类5种、酸类6种、酯类18种和呋喃1种，其总含量高达96.20%。
2.2.1醇类化合物的风味特征及脱腥前后的变化
如表4所示，豪猪肝脱腥前被检测出12种醇类化合物，相对含量达21.244%。饱和醇类物质具有较高的阈值对风味贡献不大，而不饱和醇类阈值低对风味贡献较大。实验中检测到不饱和醇类主要有1-辛烯-3-醇、1,5-辛二烯-3-醇、2-辛烯-1-醇、2-戊烯醇等，其中含量最高的为1-辛烯-3-醇，达13.8%。 1-辛烯-3-醇是亚油酸的氢过氧化物的降解产物， 具有类似蘑菇的气息[6]。但是赵亮等[7]认为1-辛烯-3-醇具有一定的土腥味，在许多海鲜产品中如小龙虾、对虾、海蟹中也是广泛存在的。检出的饱和醇如己醇、戊醇、辛醇等产生较为柔和的气味[8]，因为它们的阈值比较高，对风味的贡献很小。所以，不饱和醇类化合物是导致豪猪肝具有腥味的原因之一。
表4 发酵法脱腥前后醇类化合物的变化
注：a表示未脱腥和发酵法脱腥检测到的物质含量为相对含量；ND表示未检测到(表5-表10与此相同)。
豪猪肝经酵母发酵后，被检测出18种醇类化合物，相对含量达71.25%。与脱腥前比较，饱和醇类物质增加了58.68%，不饱和醇类物质减少了8.67%。其中脱腥前含量最高挥发性风味物质1-辛烯-3-醇经酵母发酵处理后，相对含量由13.80%降低到7.20%。除此之外，2-戊烯醇和1-戊烯-3-醇在发酵后未被检测到。
2.2.2醛类化合物的风味特征及脱腥前后的变化
由表5所示，未脱腥的豪猪肝经固相微萃取提取，气质联用检测后，共检测到9种醛类化合物，相对含量为16.932%，其阈值较低，对豪猪肝的总体风味有重要贡献。烷基醛、烯醛和二烯醛可能是由多不饱和脂肪酸如亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸氧化性成分氢过氧化物的裂解而形成的[9]。饱和直链醛己醛、辛醛、壬醛等对豪猪肝的风味贡献较大，这些饱和直链醛通常呈现一些令人不愉快的草味和辛辣的、尖刺的刺激性气味并带有油和蜡的特征风味[10]，而且醛类在低阈值浓度时有着显著的加和作用[11]。己醛有明显的青草气味，一般被认为是腥味的代表物质，是腥味的关键成分。DRUMM[12]等人已证实了辛醛和壬醛是油酸氧化的产物。一些相对分子质量低的醛类化合物对食品的特征风味有贡献，尤其是一些烯醛类及二烯醛类化合物。SUNGIM等[13]用SDE法从新鲜猪肝中收集挥发性化合物，用GC-MS结合GCO进行挥发性风味分析。结果表明，2,4-癸二烯醛、2-壬烯醛、2-辛烯醛等是形成肝腥味的主要成分。YOSHIWA等[14]用蒸馏提取法从新鲜的沙丁鱼碎肉中和在10 ℃条件下贮存了24 h的沙丁鱼碎肉中收集挥发性化合物，用GC-MS分析。结果表明，2,4-庚二烯醛、3,5-辛二烯醛、2,4-癸二烯醛和2,4,7-癸三烯醛等是形成沙丁鱼特征腥味的主要成分。所以，本实验中检出己醛、辛醛、2-辛烯醛、2,4-己二烯醛和2-庚烯醛为豪猪肝挥发性风味的主要呈味物质。
酵母法脱腥后，所检测出的醛类化合物的数量减小到5种，相对含量只有1.721%。呈腥味的饱和醛类物质正己醛和辛醛的相对含量分别减小了10.963%和0.531%，一些不饱和醛类化合物如2,4-己二烯醛、2-庚烯醛等在脱腥后未被检测到。
表5 发酵法脱腥前后醛类化合物的变化
2.2.3酮类化合物的风味特征及脱腥前后的变化
如表6所示，脱腥前的豪猪肝的风味物质经GC-MS共鉴定出11种酮类化合物，相对含量为19.395%。酮类化合物可能是由于多不饱和脂肪酸的热氧化或降解、氨基酸降解或微生物氧化产生的。挥发性成分中的酮类主要呈桉叶味、脂肪味和焦燃味，这些酮类成分对腥味起增强作用。烯酮类则是在加热期间生成的脂质氧化的产物，如1-辛烯-3-酮、3,5-辛二烯-2-酮等。
表6 发酵法脱腥前后酮类化合物的变化
豪猪肝经酵母脱腥后，酮类化合物的种类和相对含量都有所下降，挥发性酮类物质有6种，相对含量4.502%。一些小分子酮类物质，如3-辛酮和2-庚酮在脱腥后反而增多了，这可能是由于脱腥过程中一些大分子酮类被分解成小分子，同时也表明这些小分子酮类对腥味贡献不大。其中6-甲基-5-庚烯-2-酮是在加热期间生成的脂质氧化产物，具有植物芳香的气味特征[15]。
2.2.4酯类化合物的风味特征及脱腥前后的变化
脱腥前的豪猪肝含有较少量的酯类化合物，共鉴定出3种酯类化合物，相对含量0.722%。一般来说，酯类化合物给予食品一种甜的果香。然而，脱腥后酯类化合物的种类和含量都大大提升，有18种酯类化合物，相对含量达15.071%。从表7可知，脱腥后的豪猪肝中挥发性酯类物质的提升，较好地改善了豪猪肝的风味。
2.2.5酸类化合物的风味特征及脱腥前后的变化
如表8所示，酸类化合物的种类和相对含量分别为6种和22.491%，酸是醛进一步的氧化产物， 对腥味的产生影响不大，主要呈酸味。脱腥后，酸类物质的种类未发生改变，但是含量大大减少。
表7 发酵法脱腥前后酯类化合物的变化
表8 发酵法脱腥前后酸类化合物的变化
2.2.6烃类化合物的风味特征及脱腥前后的变化
如表9所示，通过GC-MS鉴定出豪猪肝中挥发性烃类化合物10种，相对含量6.002%。烃类化合物可能是通过烷基自由基的脂质自氧化过程或类胡萝卜素的分解生成，其阈值较高，因此对肝特殊风味的形成直接贡献不大，但是2,2-二甲基-4-癸烯和2-辛烯等烯烃在一定条件下形成酮或醛，是产生腥味的潜在因素。然而，脱腥后烃类化合物只有3种，相对含量0.573%，种类和含量均大大减小。
表9 发酵法脱腥前后烃类化合物的变化
2.2.7杂环类化合物的风味特征及脱腥前后的变化
如图10所示，豪猪肝经萃取检测出2种环状化合物，均为呋喃类，相对含量1.36%。环状化合物中，呋喃类可能会产生腥味[16]。然而，酵母发酵后只有0.617%的2-正戊基呋喃，可见酵母脱腥对于脱除呋喃类腥味物质具有明显作用。
表10 发酵法脱腥前后杂环类类化合物的变化
酵母发酵脱腥后，豪猪肝的主要挥发性风味物质如醛类、烯醇类、烯酮类和呋喃类化合物的种类和含量都大大减少，然而脱腥后酯和饱和醇的种类和含量却大幅度增加，不仅大大减小或去除了肝腥味，还增加了一些香气，所以酵母发酵法能够有效地减小或去除豪猪肝的腥味。其中乙醇的含量大幅度增大，原因是酵母将豪猪肝中的糖发酵成了乙醇和CO2。
酵母发酵法能够有效地减少或去除豪猪肝的腥味，但是除腥的机理并未探索清楚，可能的机理是：醛、酮等挥发性腥味成分参与酵母的新陈代谢转化成无腥味的物质，或者在微生物酶的作用下发生分子结构的修饰，转化成为无腥味成分，实现脱腥[17]。
3结论
采用顶空固相微萃取和气质联用技术，鉴定出豪猪肝的挥发性风味物质主要来自醛类、烯醇类、烯酮类和呋喃类化合物，主要呈味物质为正己醛、2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、2-正戊基呋喃等。通过感官评定及电子舌主成分分析，发现酵母发酵法能够有效地降低豪猪肝的腥味程度。通过对比酵母脱腥前后的挥发性风味物质的变化，醛类、烯醇类和呋喃类化合物的种类和含量都大幅度减少。豪猪肝挥发性风味的有效改善，不仅为豪猪肝的产业化生产带来了可能，也为豪猪饲养厂及加工厂带来了商机。
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Effect of fermentation deodorization on volatile compounds of Porcupine liver
YU Xue-ping，TONG Qun-yi*
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
ABSTRACTIn this study, the volatile compounds of Porcupine liver were analyzed by headspace solid phase microextraction (HS-SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The porcupine liver was deodorized by yeast, and the deodorization conditions were optimized by orthogonal experiment based on sensory evaluation and principal component analysis (PCA) of electronic tongue. The volatile compounds of liver were analyzed before and after deodorization. The results indicated that the optimal deodorization conditions were as follows: 1.2% of yeast concentration, 35℃ of fermentation temperature and 45 min of fermentation time. The GC-MS analysis showed that, after fermentation by yeast, both the categories and amounts of volatile compounds in porcupine liver such as aldehydes and unsaturated ketones decreased. As the main off-flavors in porcupine liver, hexanal,2-heptenal, 2-octenal, 1-octen-3-one, 1-octen-3-ol and 2-pentyl-furan also decreased. Therefore, the fermentation by yeast could decrease or remove the off-favor of the Porcupine liver.
Key wordsPorcupine liver; fermentation; deodorization; flavor
收稿日期：2015-08-31，改回日期：2015-10-09
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601008
第一作者：硕士研究生(童群义教授为通讯作者,E-mail:qytong@263.com)。
