猫传染性鼻气管炎病毒的分离与鉴定

刘 健，李 鑫，徐 锋，杨显超，邓 波，杨德全，鞠厚斌，葛 杰，龚国华，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）



猫传染性鼻气管炎病毒的分离与鉴定

刘 健，李 鑫，徐 锋，杨显超，邓 波，杨德全，鞠厚斌，葛 杰，龚国华，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

摘 要：采用直接免疫荧光和测序方法对5株病毒分离株进行了病毒的鉴定；并采用免疫学、化学和生物学方法对这5株病毒分离株进行了研究。结果显示，5株病毒分离株被鉴定为猫疱疹病毒I型；gD序列未发生变化；病毒仅在F81细胞中增殖，能引起F81细胞明显的细胞病变；猫、公鸡、人O型、牛、猪、兔、绵羊的红细胞不具有凝集作用；病毒对pH3.0、有机溶剂和60℃高温敏感；病毒蚀斑形成单位为3×106个PFU/mL，纯化株TCID50值为10-5.0TCID50/0.1mL。该研究结果表明，上海地区宠物猫存在猫传染性鼻气管炎流行风险，其病原为猫疱疹病毒I型且部分病原特性未发生变化。

关键词：猫疱疹病毒I型；分离；鉴定

猫传染性鼻气管炎（fe l i n e i n f e c t i o u s rhinotracheitis）是由疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科的猫疱疹病毒I型（Feline Herpesvirus type 1，FHV-1）引起的以急性上呼吸道症状为特征的高度接触性传染病，具体症状包括：角膜结膜炎、上呼吸道感染和流产，但以上呼吸道症状为主[1]。本病临床常见于猫，亦见于其他猫科动物[2]，猫的发病率很高，可达100%，但病死率在不同年龄的猫上差异很大，成年猫一般不引起死亡，但幼仔猫的死亡率可达50%[3]，患病动物可终生带毒排毒，且在一定的刺激下反复感染。Crandell和Maurer于1958年首次从仔猫体中分离到该病毒[4]，但是国内FHV-1分离的报道却相对较少。

2014年年底上海某宠物医院陆续收治了多起疑似FHV-1感染的病例，笔者对其中13例疑似感染FHV-1的猫进行了样品采集、病毒分离和鉴定，最终从13份样品中分离鉴定了5株FHV-1，分别命名为FHV-1/Cat/Shanghai/01/2014、FHV-1/Cat/ Shanghai/02/2014、FHV-1/Cat/Shanghai/03/2014、FHV-1/Cat/Shanghai/04/2014和FHV-1/Cat/ Shanghai/05/2014，并对FHV-1/Cat/Shanghai/01/2014株进行部分理化特性和生物学特性研究。

1　材料和方法

1.1样品来源 样品来源于上海某宠物医院，采集的对象为疑似FHV-1感染的猫。采集方法：用无菌棉拭子轻轻擦拭疑似猫的结膜、鼻腔及口腔，将采集好的棉拭子放入盛有无菌DMEM培养基的离心管中，冷藏，24 h内送至实验室。

1.2细胞系 F81（猫肾传代细胞）购自中国科学院细胞库；Marc-145（猴肾细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）、MDCK（犬肾细胞）、BHK-21（乳仓鼠肾细胞）、PK-15（猪肾细胞）、ST（猪睾丸细胞）与IEC18（大鼠回肠细胞）均由上海兽医疾病诊断中心保藏。细胞按常规消化传代，37℃静置培养。

1.3主要试剂 TaqDNA聚合酶、pMD18-T载体和DH5α感受态细胞均购自宝生物工程（大连）公司；DNA提取试剂盒购自AXYGEN公司；胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；FHV-1免疫荧光抗体购自青岛瑞尔生物科技有限公司（批号：CJ-FVR-10ML）。

1.4病毒的分离与鉴定

1.4.1病毒的分离 对13份疑似FHV-1感染猫的眼结膜棉拭样品进行病毒分离。参照文献[2]，将样品接种于长成单层的F81细胞，吸附1～2 h，弃去液体，加入10 mL病毒维持液（DMEM+2%FBS），于37℃静置培养4～5 d，每天观察细胞变化。如无病变则于培养后的d4～5收取上清，细胞继续按常规传代培养，至第3代仍无病变时判为阴性，停止分离；如出现病变则冻融3次收毒，放-30℃待鉴定[5]。

1.4.2病毒的鉴定

1.4.2.1FHV-1直接免疫荧光检测 用-30℃冰预冷甲醇固定液固定细胞20 min，pH9.0 PBS洗液洗涤3次，每孔0.5 mL，每次5 min，将加热至室温的荧光抗体加入到孔中，每孔0.5 mL，37℃孵育30 min，pH9.0 PBS洗液洗涤3次，每次浸泡5 min，最后一次浸泡10 min，在荧光显微镜下观察是否有特异性荧光呈现[6]。

1.4.2.2gD序列的测定 参照文献[7,8]提供的方法扩增上述病毒gD片段，并将PCR产物电泳经凝胶回收后，按pMD18-T载体说明书进行连接、转化，阳性克隆送桑尼生物有限公司测序。并将获得的gD序列上传至GeneBank。Blast分析临床分离株的gD序列与GeneBank的参考株及疫苗株之间gD序列的同源性。

1.5红细胞凝集试验 测定分离毒对猫、公鸡、人O型、牛、猪、兔、绵羊动物红血球（10 mL/L）的凝集活性[9]。

1.6病毒部分理化特性的测定[9]取FHV-1/Cat/ Shanghai/01/2014第5代培养物50 mL分成5瓶，每瓶10 mL，第1瓶于50℃水浴作用30 min；第2瓶加20%乙醚振荡10 min放4℃过夜后，无菌挥发除去全部乙醚；第3瓶先用0.1mol/LHCl调pH至3.0，于4℃作用2 h后，用0.1mol/L NaOH调pH至7.2；第4瓶也是用0.1mol/L HCl调pH至5.0于4℃作用2 h后，再用0.1mol/L NaOH调pH至7.2；第5瓶不处理作为正常对照。然后分别用F81细胞测定这5瓶FHV-1/Cat/ Shanghai/01/2014的TCID50。

1.7细胞敏感谱试验结果[9]用FHV-1/Cat/ Shanghai/01/2014第5代培养物接种F81、Marc-145、Vero、MDCK、BHK-21、PK-15、ST与IEC18细胞后，以细胞病变（cytopathic effect，CPE）为感染指标，按Reed-Muench法计算各细胞培养物的TCID50。

1.8FHV-1细胞病变的观察 取FHV-1/Cat/ Shanghai/01/2014第5代培养物200μL，接种到长成单层的F81细胞，并加入10 mL细胞培养液，并设置对照组，每12 h观察细胞一次，并记录细胞形态的变化。

1 .9病毒的蚀斑纯化[ 1 0 ]选取F H V - 1 / C a t / Shanghai/01/2014分离株，将病毒培养液作10倍系列稀释到10-10，接种长成良好的F81细胞单层的6孔细胞培养板；每孔接种病毒稀释液200μL，每个稀释度病毒液接种2孔，置细胞培养箱中吸附1 h，每20 min摇动一次使病毒分布均匀；吸附后弃去板内病毒液；然后取2×细胞培养液加入等量的4%琼脂（60℃水浴加热）中，混匀，冷却到40℃时加入细胞培养板中，每孔加入2 mL，凝固后置37℃含5%CO2的细胞培养箱中继续培养；培养48 h后添加第2层琼脂，并在第2层琼脂中添加浓度为3%的中性红，继续在37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养48～72 h，待出现单个蚀斑后计算出现蚀斑的最高稀释度及其蚀斑平均个数，获得其病毒的浓度。吸取噬斑处琼脂加入营养液中使其溶解后作为收获病毒，收获后的病毒液接种单层F81细胞继续培养增殖，得到纯化的FHV-1病毒。

1.10病毒滴度的测定[11]将上述纯化的病毒培养液做10倍系列稀释到10-12，接种长成良好的F81细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，0.1mL/孔，置37℃含5%CO2的细胞培养箱中继续培养，每隔12 h观察1次，记录发生细胞病变的病毒稀释度和孔数，4～5 d后停止观察，记录最终发生细胞病变的的稀释度和孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。

2　结果

2.1病毒分离结果 将处理好的13份棉拭子接种F81细胞，其中5份第1代就出现了CPE，细胞在24～48h出现病变，48 h后基本脱落。表现为细胞肿胀变圆，折光性增强，开始时聚缩成葡萄串状，后呈散鱼籽样，最后脱落成碎片状。

2.2病毒直接免疫荧光鉴定结果 将13份细胞上清液接种长满单层的F81细胞，经直接免疫荧光检测，结果表明，其中5份细胞上清液接种F81细胞后，在胞浆内可观察到特异性绿色荧光，未接种细胞上清液的细胞没有观察到任何特异性荧光（见图1）。

图1　FHV-1分离株感染F81细胞直接免疫荧光检测Fig. 1 F81 cells infected with the FHV-1 by direct immunofl uorescence assayA: 10×20倍; B: 10×63倍; C: 正常F81细胞A: 10×20 times; B: 10×63 times; C: Normal F81 cells

2.3病毒gD基因测序鉴定结果 FHV-1的gD基因全长为1125bp大小，参考文献的方法，对5个分离毒进行gD基因序列的扩增，并进行测序了比对，测序结果上传到GeneBank中，登录号：KT963463（A）、KT963464（B）、KT963465（F）、KT963466 （H）和KT963467（K）。结果表明临床分离的5株分离毒的gD序列与GeneBank的参考序列FHV-1 gD序列同源性为100%，与疫苗毒的gD序列同源性也为100%，5株分离株gD序列相互间的同源性也为100%[12]。

2.4病毒红细胞凝集试验结果 采用微量血凝法测定[13]的不同动物的红细胞对FHV-1/Cat/ Shanghai/01/2014、FHV-1/Cat/Shanghai/02/2014、FHV-1/Cat/Shanghai/03/2014、FHV-1/Cat/ Shanghai/04/2014和FHV-1/Cat/Shanghai/05/2014的HA效价，结果均小于1:2，表明5株分离株均不凝集以上红细胞。

2.5病毒部分理化特性测定结果 选取其中FHV-1/Cat/Shanghai/01/2014株作部分理化特性的研究，研究结果表明FHV-1/Cat/Shanghai/01/2014株在F81细胞上的感染滴度为10-4.8TCID50/0.1mL，而经50℃、60℃、20%乙醚、pH3.0和pH5.0处理后，再测定其滴度：10-3.0TCID50/0.1mL、0、0、0、10-4.8TCID50/0.1mL，说明该毒株对60℃经30 min、20%乙醚和pH3.0敏感；对50℃经30 min较为敏感；对pH5.0不敏感。

2.6病毒细胞敏感谱试验结果 用FHV-1/Cat/Shanghai /01/2014接种F81、Marc-145、Vero、MDCK、BHK-21、PK-15、ST与IEC18细胞，以CPE为感染指标，计算各细胞培养物的TCID50值。结果仅对F81细胞感染，且滴度为10-5.0TCID50/0.1mL，对细胞不感染，且滴度为0。表明在本研究所选用的细胞系中，该病毒仅对F81细胞敏感。

2.7病毒蚀斑克隆纯化结果 选取FHV-1/Cat/Shanghai /01/2014分离株作病毒的蚀斑克隆纯化，在其第6个稀释度时能明显观察到单个蚀斑，通过计算其蚀斑形成单位（Plaque forming units，PFU）为3×106个PFU/mL，并通过克隆得到FHV-1/Cat/ Shanghai/01/2014纯化株。

2.8病毒TCID50测定结果 对FHV-1/Cat/Shanghai/ 01/2014纯化株进行TCID50的测定，其病毒滴度值为10-5.0TCID50/0.1mL。

3　讨论

本研究对上海某宠物医院送检的13份猫棉拭子样品采用猫肾传代细胞F81进行FHV-1病毒分离，获得5株病毒，经细胞病变观察、直接免疫荧光检测和gD序列测定，分离的5株病毒均在第1代就出现了CPE，接毒后细胞在24～48 h出现病变，48 h后基本脱落。采用直接免疫荧光检测时能在细胞中观察到FHV-1的特异性免疫荧光，基因测序结果表明其gD序列与Genebank中已发表的序列和疫苗毒的gD序列同源性都为100%，研究表明5株分离株均为猫疱疹病毒1型。

对FHV-1/Cat/Shanghai/01/2014进行了部分理化特性和生物学特性的研究，结果表明病毒对猫、公鸡、人O型、牛、猪、兔、绵羊动物红血球均无血凝作用，但是有学者认为病毒对猫红细胞有血凝作用[12,14]。通过测序分离株的gD序列与传统的病毒的gD序列同源性为100%，而gD基因是决定病毒血凝活性的主要基因[12]，因此血凝性的改变是由何种原因造成值得进一步研究。病毒接种F81、Marc-145、Vero、MDCK、BHK-21、PK-15、ST 与IEC18细胞后，只在猫肾细胞F81中生长，并出现细胞病变，但在Marc-145、Vero、MDCK、BHK-21、PK-15、ST与IEC18细胞中不能生长或不能产生细胞病变；病毒对pH3.0、有机溶剂和60℃高温敏感，对50℃较为敏感，对pH5.0不敏感；采用病毒蚀斑克隆纯化方法对FHV-1/Cat/Shanghai/01/2014株进行纯化，纯化后的病毒滴度为10-5.0TCID50/0.1mL。

近年来随着人民生活水平的提高，猫作为伴侣动物已逐渐成为城市生活不可或缺的部分，但传染性疾病常成为宠物猫患病和死亡的主要根源。目前，猫传染性鼻气管炎主要依靠疫苗防控，药物治疗效果欠佳[15]，主要原因是其确诊较为困难[16,17]，容易造成继发感染。同时，临床经常发现免疫过FHV-1疫苗的猫依然会感染FHV-1，究竟是疫苗免疫效果不好、还是免疫程序有问题导致免疫失败仍需要进一步研究。

参考文献

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·研究论文·

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF FELINE INFECTIOUS RHINOTRACHEITIS VIRUSES

LIU Jian, LI Xin, XU Feng, YANG Xian-chao, DENG Bo, YANG De-quan, JU Hou-bin, GE Jie, GONG Guo-hua, ZHOU Jin-ping

(Shanghai animal disease prevention and control center, Shanghai 201103, China)

Key words:Feline Herpesvirus type I; isolation; identifi cation

Abstract:Five isolates of feline infectious rhinotracheitis virus strains were identifi ed in the present study using immunology, chemistry and biology methods. gD sequences had no mutations these isolates grew in F81 cells only and caused noticeable cell lesions. The viruses did not agglutinate red blood cells of cats, cocks, human o type, cattle, pigs, rabbits and sheep. The viral liability was sensitive to pH3.0, organic solvent and heating at 60℃. The plaque forming unit was determined to be 3×106PFU/mL, and TCID50was 10-5.0TCID50/0.1mL. In conclusion, these fi ve feline infectious rhinotracheitis viruses resembled with previously isolated strains.

中图分类号：S852.659.5

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2016）01-0022-05

收稿日期：2015-12-01

基金项目：上海市农业基础性项目（沪农科攻字（2014）第7-3-3号）；上海市市级农口系统青年人才成长计划（沪农青字（2015）第2-8号）

作者简介：刘健，男，兽医师，硕士，主要从事动物病毒学研究

通信作者：周锦萍，E-mail：shzjpvet@163.com