猫杯状病毒的分离鉴定及其全基因组的序列分析

何 平，杨文娟，李法凯，赵卫锋，周华波，李瑞凯，梁明丽，韦红云，何剑桥，祝 健，韦祖樟，黄伟坚，陈 樱

（1. 广西大学 动物科学技术学院，南宁 530004；2. 南宁市华波宠物医院，南宁 53004）



猫杯状病毒的分离鉴定及其全基因组的序列分析

何 平1，杨文娟1，李法凯1，赵卫锋1，周华波2，李瑞凯1，梁明丽1，韦红云1，何剑桥1，祝 健1，韦祖樟1，黄伟坚1，陈 樱1

（1. 广西大学 动物科学技术学院，南宁 530004；2. 南宁市华波宠物医院，南宁 53004）

摘 要：本研究采用MDCK细胞从养殖场患病猪的鼻拭子样品中分离获得1株猫的杯状病毒（Feline calicivirus，FCV），命名为GX01-2013。采用RT-PCR方法扩增了该毒株的全基因组，并进行了序列测定和分析。结果表明，该毒株基因组全长7704 bp，与哈尔滨分离株HRB-SS较为相近，其核苷酸同源性为82.3%。根据FCV衣壳蛋白构建的遗传进化树分析，发现该病毒与F9、F4、225和2024疫苗株均不在同一分支，氨基酸同源性为84.2%～87.7%，各毒株间无明显地域差异。此外，VP1蛋白的E区（426～521aa）发现有4个中和性抗原位点发生改变。

关键词：猫杯状病毒；全基因组；遗传进化分析

猫杯状病毒（Feline calicivirus，FCV）属于杯状病毒科，杯状病毒属，单股正链RNA病毒，是一种主要引起猫科动物多发性口腔和呼吸道疾病、慢性胃炎的重要病原[1]，由于病毒株毒力强弱及动物抵抗力的不同，有些病毒株引起猫的急性关节炎、肠炎、肺炎及跛行综合征等[2]。目前认为猫杯状病毒呈世界性分布，其在猫科动物中具有高度的传染性，猫及某些野生动物猎豹[3]、虎[4]和狮[5]等对其均有易感性，症状的严重程度随病毒毒力的强弱和动物年龄的差别而不同，但以一岁以下的猫易感性最高，也有感染狗的报道[6]。由于该病毒是杯状病毒科中唯一可在体外成功培养的病毒，因此可通过对该病毒的培养来进一步了解其他杯状病毒。本研究从发病猫场的鼻拭子中，利用MDCK细胞分离获得1株FCV，并对其进行了全基因组扩增和序列测定，为进一步研究广西FCV的分子流行病学和生物学特性奠定基础。

1　材料与方法

1.1样品来源及处理 2013年9月柳州某养猫场发生呼吸道疾病，发病率约为30%，患病猫群体温为39.3℃～41.5℃，出现流鼻涕，口和眼的分泌物较多。采集患病猫的鼻拭子及其分泌物30份，将混合物放入PBS液（pH=7.2～7.6，2000U/mL青链霉素）中，振荡2～4min后，15 000×g离心5 min，弃去棉拭子，将上清保存于－80℃备用。

1.2细胞和主要试剂 MDCK细胞由广西壮族自治区疾病预防控制中心惠赠，由本实验室保存。E.coli DH5α 感受态细胞购自TIANGEN公司；pMD18-T Vector、LA Taq DNA polymerase（5 μL）购自TaKaRa；细胞裂解液RNAiso plus、dNTP、RNasin酶抑制剂、M-MuLV Reverse Transcriptase（200 U/μ L）购自大连宝生物公司；Easy Taq DNA

polymerase购自全式金生物公司；柱式质粒小量抽提试剂盒购自OMEGA公司；通用型DNA胶回收试剂盒购自TIANGEN公司；DMEM细胞培养液以及胎牛血清为Gibco产品。

1.3病毒分离 MDCK细胞培养至单层，首先用PBS 洗2遍，然后将过滤好的鼻咽拭子混合物分别接种细胞，孵育1 h后，弃上清，将配好的不含FBS的细胞培养液接种MDCK，37℃培养48 h，每12 h观察是否出现细胞病变（cytopathic effect，CPE），48 h后取上清进行鉴定。

1.4病毒RT-PCR鉴定 参考Abd-Eldaim[7]的引物设计和PCR程序。取200μL，按照说明书提取病毒总RNA。用猫杯状病毒的P6引物，并按照AMV反转录酶使用说明书进行反转录合成cDNA。25 μL反转录体系：5×Buffer 5 μ L，2.5mmol/L dNTP mix 2 μL，引物 1 μL，M-MLV反转录酶 0.5μL，RNasin抑制剂 0.5μL，RNA 16 μL。置PCR仪42℃反转录1 h。阳性对照为猫三联苗，商品名为“妙三多”（美国辉瑞）；ddH2O为阴性对照。

1.5病毒全基因组扩增 根据GenBank中已知的FCV全基因组序列并参考郑翠玲等[8]设计了如下引物（见表1）。按照1.4的方法提取病毒RNA和反转录，取5 μL cDNA进行PCR实验。PCR反应条件：95℃预变性2 min，1个循环；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸4 min，30个循环；72℃延伸10 min；最后4℃保存。用OMEGA胶回收试剂盒回收PCR产物后，克隆于pMD18-T载体，转化宿主菌DH5α。将阳性重组质粒送往上海杰李生物技术公司进行序列测定。

表1 本文所使用的引物及其序列Table 1 The primers used in this paper

1.6基因序列分析及其遗传演化分析 将所测的序列应用Lasergene DNAStar 7.1软件中的Seqman进行拼接，并在NCBI（BLAST，megablast; http://www. ncbi.nlm.nih.gov/）上进行检索确认。用MEGA6.0 beta软件来构建系统发育进化树。

2　结果

2.1病毒分离情况 将RT-PCR鉴定为阳性样品接种单层MDCK细胞，其中1份样品接种细胞后，48 h出现皱缩、变圆，呈葡萄串状的CPE现象（图1）。随着病毒传代数（第11代）的增加，病毒引起细胞病变速度加快，说明病毒对MDCK细胞的适应性逐渐增强。对该毒株进行RT-PCR鉴定，结果显示，第3代的细胞上清可以扩增获得约550bp左右的目的片段，与预期相符（图2）。将该分离株命名为FCV/ Feline/Guangxi/01/2013(GX01-2013)。

图1　分离株GX01-13细胞培养48 h时细胞病变图Fig. 1 CPE in MDCK cells at 48 hpiA: 阴性对照; B: GX01-2013毒株A: Negative control; B: GX01-2013 isolate

图2　分离株GX01-2013的RT-PCR检测Fig. 2 Detection of GX01-2013 isolate by RT-PCRM: DNA分子量标准(DL2000); 1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: 病毒样品M: DNA Marker(DL2000); 1: Positive control; 2: Negative control; 3: Virus sample

2.2病毒全基因组扩增 运用表1中的3对特异性引物对GX01-2013进行RT-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见预期大小条带，其中P1P2引物扩增的片段为2464 bp，P3P4引物扩增的片段为2901 bp，P5P6引物扩增的片段为2366 bp（图3）。基因序列见GenBank（登录号：KT970059）。

图3　分离株GX01-2013全基因组扩增图Fig. 3 PCR results of GX01-2013 genomeM: DNA分子量标准(DL15000); 1: P1P2引物扩增产物(2464 bp); 2: P3P4引物扩增产物(2901 bp); 3: P5P6引物扩增产物(2366 bp)M: DNA Marker(DL15000); 1: Segment from P1P2 Primers (2464 bp); 2: Segment from P3P4 Primers (2901 bp) ; 3: Segment from P5P6 Primers (2366 bp)

2.3衣壳蛋白基因（open reading frame，ORF2）序列的遗传进化分析 本研究还选取了25株国内外流行毒株和疫苗株与该分离株的衣壳蛋白基因（ORF2）进行了序列分析，并构建了核苷酸和氨基酸遗传进化树（图4）。从核苷酸序列进化树分析可以看出，该毒株与中国其他分离株CH-GD、FB-NJ-13 和HRB-SS均不在一个分支上，其分布无地域性差异。此外，氨基酸序列进化树中，该毒株虽与美国的UTCVM-H1、UTVCM-H2和FCV-182cvs5A毒株在同一大分支上，但亲缘关系较远；与疫苗株F9、F4、225和2024均不在一个分支上。初步推断该分离株不属于疫苗株。

2.4全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性分析 全基因组核苷酸序列同源性分析发现GX01-2013与哈尔滨分离毒株HRB-SS的核苷酸同源性最高，为82.3%，与疫苗株F9、2024和F4的核苷酸同源性分别为78.5%、78.7%和79.6%（表2）。其中编码病毒非结构聚蛋白ORF1基因相对保守，与HRB-SS的氨基酸同源性高达93.9%；ORF2的超变区基因差异较为显著，与HRB-SS的同源性仅为68.1%，与商业化疫苗株的氨基酸同源性为63.6%～72.7%，结果符合FCV的分子生物学特征。编码VP2蛋白的ORF3基因氨基酸同源性在80.4%～91.6%，与FCV-225株的同源性相对较低，为80.4%。

图4　分离株GX01-2013衣壳蛋白核苷酸（a）和氨基酸序列（b）遗传进化分析图Fig. 4 Phylogenetic analysis of FCV capisd nucleotide(a) and amino acid (b) sequences注: 圆圈代表本实验分离毒株; 三角形代表疫苗株Note: Black circles are the isolates in our study; triangles are the vaccine strains

表2 GX01-2013分离株全基因组和各片段的核苷酸与氨基酸序列同源性分析Table 2 Nucleotide and amino acid sequences identity between GX01-2013 strain and other strains

3　讨论

猫杯状病毒是引发猫科动物出现急性或者慢性上呼吸道疾病的病原之一。感染后动物出现呼吸道和口腔溃疡、鼻炎、眼结膜炎和口腔炎症。临床上表现为严重的流鼻涕，嗜睡、厌食、发烧、食欲下降和跛行，严重的可引发肺炎和流产等。康复猫和隐性感染的猫是病原的主要携带者。近年来频有FCV强毒变异株感染的报道，即使是接种了疫苗的猫也有可能会发生感染[9]，2003年英国及2009年法国就曾爆发过疫苗免疫的成年猫以黄疸、水肿、高死亡率为特点的全身性疾病（virulent systemic disease，VSD）[10]。本研究发现免疫猫三联疫苗的猫场暴发了猫的杯状病毒，发病率高达30%，死亡率约1%，通过RT-PCR鉴定和病毒分离获得了分离株GX01-2013。由于当时疑似流感病毒与其混合感染，因此将阳性样品接种于MDCK细胞进行分离，接种48 h后，发现MDCK细胞出现较为明显的CPE，经RT-PCR鉴定为FCV。连续传11代后，发现该病毒仍能较好地在MDCK细胞保持稳定增殖。然而，目前报道FCV大多在CRFK、F81、DK、Vero等细胞分离获得，并且猫肾细胞较为敏感[11]。本研究所分离毒株对MDCK细胞较为易感，在研究中较为少见，其生物学特性有待进一步研究。

本研究获得的GX01-2013基因组全长7704 bp，ORF1的长度为5292 bp（20～5311），ORF2为2007 bp （5314～7320），ORF3为321 bp（7317～7637）。ORF3起始密码子与ORF2的终止密码子有4个核苷酸重叠，与过去的报道的一致[12]。但是ORF3的终止密码子（TAG）与国外疫苗株（F9、F4、225和2024）的TGA有不同，而且3'端的非编码区延伸到7704个碱基。不同基因组长度是否与其临床表现相关，有待进一步研究。通过比较各毒株之间的衣壳蛋白核苷酸和氨基酸序列，发现FCV之间无明显的地域差别，同一个国家之间的FCV相差甚远。尽管全基因组序列分析发现分离株与HRB-SS在一个分支（数据未出示），但是衣壳蛋白氨基酸序列分析，却发现分离株与中国的FCV毒株NJ-13、CH-GD、HRBSS均不在一个分支。通过比较该分离株与疫苗株F9、F4、225和2024不同基因片段之间的差别，编码多聚蛋白的ORF1片段，在FCV中相对较保守，氨基酸同源性高于90%。编码结构蛋白VP2的ORF3片段与HRB-SS的氨基酸同源性高达91.6%，而与其他疫苗株氨基酸同源性为80.4%～89.6%。ORF2片段编码FCV的衣壳蛋白，它分为A、B、C、D、E 和F等6个区，其中E为超变区，各毒株之间的氨基酸同源性为84.2%～87.7%。疫苗免疫失败多数与病毒变异相关，该病毒最易发生变异的蛋白为衣壳蛋白（VP1），特别是VP1蛋白中的E区。E区大约在427～524 aa 之间，含有 FCV 的抗原表位，该区被28 个保守序列（con E）分成 5'端（33 aa）和 3'端（34 aa）高变区（HRV），被作为流行病学调查的工具[13]。因此，我们对该毒株的E区进行了氨基酸位点分析。由于受到宿主的免疫压力影响，几乎所有的变异都发生在衣壳蛋白，其中E区的超变区抗中和位点发生改变，T441→A、A448→K、K449→A和D494→N，这些氨基酸的改变是否影响病毒的嗜性或者病毒的毒力和复制能力，有待进一步研究。

根据目前国内对FCV的流行情况分析，FCV不仅危害宠物猫，而且对大型猫科动物也具有致病性。国外已经研制出FCV疫苗预防该病的发生，但是随着FCV的频繁变异，当前的疫苗株可能丧失了一定保护力。因此，加强对FCV的流行病学情况调查，分离获得更多毒株并了解其生物学特性，为今后筛选疫苗候选株和研发新型疫苗提供科学参考。

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·研究论文·

SEQUENCE ANALYSIS OF THE COMPLETE GENOME OF FELINE CALICIVIRUS ISOLATE

HE Ping1, YANG Wen-juan1, LI Fa-kai1, ZHAO Wei-feng1, ZHOU Hua-bo2, LI Rui-kai1, LIANG Ming-li1, Wei Hong-yun1, HE Jian-qiao1, ZHU Jian1, WEI Zu-zhang1, HUANG Wei-jian1, CHEN Ying1

(1. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. Huabo Pet Hospital, Nanning, 530004, China)

Key words:Feline calicivirus; genome; phylogenetic analysis

Abstract:A feline calicivirus strain GX01-2013 was isolated by inoculating nasal swabs of diseased cats into MDCK cells. The complete sequence of the GX01-2013 strain was amplifi ed in RT-PCR and analyzed. Its complete genome was 7704 bp in length. The nucleotide homology was 82.3% with HRB-SS strain. Phylogenetic analysis of capsid protein revealed that GX01-2013 was distant from the vaccine strains (F9, F4, 225 and 2024) as their overall similarity of amino acids ranged from 84.2% to 87.7%. In addition, no geographical difference was found among these strains. This study also revealed that four amino acid sites associated with virus neutralization altered in the E region (426-521aa) of the capsid gene.

中图分类号：S852.659.6

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2016）01-0001-06

收稿日期：2015-11-20

基金项目：广西教育厅高校科学技术研究项目（YB2014005）；广西大学科研基金项目（XJZ140236）；广西自然科学基金回国项目（2015GXNSFCA139002）

作者简介：何平，女，硕士研究生，预防兽医学专业

通信作者：陈樱，E-mail：yingchen@gxu.edu.cn