外泌体传输microRNA在肿瘤研究中的进展*

刘锐　综述　巴一　审校



外泌体传输microRNA在肿瘤研究中的进展*

刘锐综述巴一审校

摘要外泌体是一类可以在细胞间传递直径为30～100 nm的内吞衍生囊泡，可包含与其来源和功能相关的蛋白质和RNA等物质。外泌体作为一种天然的载体，已被视为一种新型的药物传输系统用于肿瘤的治疗。microRNA（miRNA）是一类新型的RNA调控基因，不仅仅存在于细胞内，亦存在于细胞外，这些细胞外miRNA可作为分泌型信号分子影响受体细胞表型，并一定程度上反映出供体细胞内的分子改变，具有一定的诊断及潜在的治疗用途。肿瘤患者血液中外泌体高于正常人，并能够包裹肿瘤相关miRNA行使生物学功能，因此机体通过外泌体传输特异性miRNA可能在肿瘤的发病过程中扮演着重要的角色。本文将对外泌体作为miRNA的传输载体在肿瘤发生发展以及肿瘤治疗等方面的研究进行综述。

关键词microRNA外泌体诊断标志物肿瘤

作者单位：天津医科大学肿瘤医院消化肿瘤内科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室（天津市300060）

*本文课题受国家自然科学基金（编号：81201946）资助

外泌体是产生自人体自身直径为30～100 nm的囊泡，大部分的细胞系均可释放，几乎存在于所有的体液中。其可以在相邻细胞或远端细胞间运载生物活性分子（如蛋白，脂类及核酸），且携带的分子能够引起受体细胞的信号反应，介导细胞间的物质交换。因此，外泌体被认为是微环境的信号分子，能够运输功能性RNA，包括外源性的siRNA到受体细胞中，调节目的基因表达，从而治疗某些疾病。目前外泌体对miRNA的传输及其在细胞间的通讯作用越来越受到研究者们的关注，且其在肿瘤的诊断和治疗中具有一定临床意义。本文将综述外泌体传输miR⁃NA在肿瘤发生发展中的生物作用，并探讨其作为肿瘤诊断标志物及用于临床治疗等方面的价值。

1　外泌体对细胞外miRNA的传输及其生物学意义

miRNA是长约22 nt的自然存在、不编码的RNA。成熟的miRNA由前体miRNA转录形成，其一般为几千个核苷酸组成。大量的细胞外miRNA存在于包括血清、血浆、尿液、乳汁等体液之中。后续研究发现，这些细胞外miRNA表达量的改变与包括肿瘤在内的很多疾病相关［1-2］。尽管细胞外存在高浓度的RNA酶，细胞外miRNA在体液中仍具有较高浓度和结构的完整性，这一现象表明细胞外miRNA可能被包裹在某种特殊的结构中从而防止被酶消化。加入血浆中的无包裹miRNA会立即被消化，而循环中的miRNA在相同条件下的数小时内是稳定且受保护的，可抵抗环境的改变如极端温度、极端酸碱度及反复的冻融［3-4］。

2013年美国和德国科学家发现了细胞囊泡运输调节机制，并由此荣获诺贝尔奖。外泌体（exosomes）作为人体内一类重要的囊泡，其生物学功能受到越来越多的关注，有研究报道细胞释放的miRNA主要包裹于小囊泡中（如外泌体、脱落的囊泡和凋亡小体）作为分泌分子影响受体细胞表型［5-6］，或通过结合到特定细胞的表面受体从而对靶细胞进行调控［7-8］。功能性的miRNA也通过该机制进行运输调控。有研究发现健康受试者血浆中外泌体包裹的miRNA的表达水平与外周血单核细胞相比存在显著性差异［9-10］，推测血浆外泌体中的miRNA可能是造血的重要调节因子。在体外研究中现从胚胎干细胞来源的外泌体可运输miRNA到小鼠胚胎成纤维细胞中行使功能［11］。另一项研究中发现，人骨髓间充质干细胞释放的外泌体包含的miRNA可通过与受体细胞的结合释放到受体细胞中行使功能［12］。有研究观察到外泌体包裹着miRNA释放到细胞外通过与相应靶蛋白的作用可抑制脂肪细胞的沉积［8］。还有研究报道绒毛滋养细胞产生的胎盘相关miRNA通过外泌体分泌进入产妇的循环系统，并证明胎盘相关的miRNA可在母体的NK细胞中与靶基因相互作用，从而揭示一种新的母体与胎盘之间信息传递的方式［13］。同样也有研究报道THP-1细胞来源的微囊泡包裹着大量的miR-150输送到人微血管内皮细胞（human microvascular endo⁃thelial cells，HMEC-1），导致血管内皮细胞的miR-150水平升高，并观察到了其与c-myb之间的靶向调控作用，促进了细胞的增殖［14］。该研究结果表明miRNA在单核细胞和血管内皮细胞之间通讯可能与心血管系统疾病发展相关。

以上研究结果所示，外泌体不仅特异性靶向于受体细胞改变其蛋白质、基因等表达，而且还通过运输miRNA参与信号传导。该过程主要是miRNA首先包裹在细胞内的外泌体中，然后进入循环系统，与细胞受体结合，作为内源miRNA行使生物学功能（图1）。由于miRNA广泛地靶向于mRNA，这种由外泌体介导的miRNA通讯在细胞间的生物信息传递中起着非常广泛的作用。miRNA的外泌体转移途径有助于局部与系统间的细胞内信息转移，但又有别于细胞接触或细胞因子等方式。

2　外泌体miRNA在肿瘤中的关联研究

肿瘤微环境在肿瘤发展过程中起着重要的作用，肿瘤细胞会影响正常细胞的稳态而出现肿瘤特性。肿瘤细胞和正常细胞在微环境中的动态交互过程是疾病进展的关键。这种交互作用可能通过分泌的小分子信号完成［15］，这类分泌型小分子已不再局限于细胞因子、趋化因子、生长因子或一些蛋白分子，外泌体包裹的分泌型miRNA亦在其中［16］。有研究证实外泌体小RNA参与了肿瘤发生、转移、免疫逃逸以及微环境的形成，与肿瘤的发生发展息息相关，可以作为新的肿瘤生物标志物。肿瘤分泌的miR-214，通过外泌体运输到受体细胞CD4+T细胞中，下调PTEN表达，最终影响调节性T细胞的功能，引起宿主免疫逃逸以及肿瘤的快速增长。近年来人们已经认识到肿瘤细胞能够操控宿主的免疫功能，机体能够通过外泌体将肿瘤特异性的miRNA运输到免疫细胞，使肿瘤发生免疫逃逸，为肿瘤免疫检查点治疗［17］提供了新的思路。

图1　外泌体在细胞间传输miRNA示意图Figure 1 Schematic of exosomal transmission of miRNAs

有研究发现人胶质瘤细胞分泌的外泌体富集mRNA和miRNA，并可作用于HMEC-1行使功能［18］，说明肿瘤细胞产生的外泌体可以通过改变转录后表达从而影响周围正常细胞的功能，同样胶质瘤患者的脑脊液中可以检测到胶质瘤特异性miR-21，且其表达水平与脑室转移、肿瘤分级及预后相关［19］。另有研究发现黑色素瘤细胞通过外泌体的包裹方式释放包括miR-214-3p、miR-199a-3p和miR-155-5p在内的小分子进入肿瘤微环境进行信息通讯，调控黑色素瘤的发展［20］。用间充质干细胞外泌体将antimiR-9分子导入胶质母细胞瘤细胞中，实现了逆转其对替莫唑胺的耐药性［21］。Ohno等［22］采用基因工程技术在外泌体包膜上表达表皮生长因子受体（epider⁃mal growth factor receptor，EGFR）结合片段GE11，从而将let-7a特异性导入EGFR表达乳腺癌细胞中，进一步的体内研究也证实包含let-7的GE11外泌体可在体内显著抑制EGFR阳性乳腺癌细胞的生长。故肿瘤细胞能够通过外泌体转运miRNA到周围的细胞，促进肿瘤的生长及发展。

3　外泌体传输miRNA在肿瘤诊断和治疗中的应用

分泌型miRNA可在生物体液中被检测出来，并能反映出生物体的生理病理状态，因此具有潜在的诊断和预后标志物的特征。有研究证实其可用于疾病诊断和预后判断，在患者血清中检测病毒分泌的miRNA可判断疾病预后［23］，具有胶质瘤、胰腺癌、胃癌等特征的miRNA能在相应患者的血清中检出［24-26］，这些研究都证明了肿瘤分泌的miRNA能够提供诊断信息，从而协助治疗。有研究发现在肺癌患者中其总外泌体数量较对照组增多，且其中所包含的miR⁃NA与其相应的肺癌组织相似［27］。另有研究证实卵巢癌患者中的外泌体水平较良性疾病患者明显升高，而且其水平与肿瘤分期相关，可用于卵巢癌的早期诊断［28］。M.D.安德森癌症中心也在Nature杂志发表了外泌体作为胰腺癌生物标志物的研究成果，除DNA和全细胞之外，肿瘤细胞脱落的外泌体也可作为替代的癌症生物标志物，其携带的DNA、RNA和蛋白质可以用来成功区分患者胰腺癌早期、晚期与良性胰腺疾病或健康受试者［29］。

近年来国外研究证实，原癌基因特性miRNA的反义寡聚核苷酸-抗miRNA寡聚核苷酸，可有效地灭活肿瘤中的“坏的”miRNA，控制肿瘤生长［30-31］从而实现一定的治疗作用。2015年Nature杂志发表了耶鲁大学的研究成果，通过靶向输送anti-miR至淋巴瘤的肿瘤微环境中，特异性抑制miR-155表达，从而起到抗肿瘤的作用［32］。用于丙肝治疗的miR-122拮抗剂已经进入了Ⅱ期临床试验，用于不能手术的原发性肝癌和肝脏受累的转移性癌症的miRNA疗法也有Ⅰ期临床试验在研。目前关于分泌型miRNA转化性的多项研究已陆续开展，分泌型miRNA用于胰腺癌诊断标志物的研究成果也已完成临床实验。外泌体在miRNA运输中的作用和意义已得到证实，进一步为分泌型miRNA真正应用于临床肿瘤的诊断及治疗等方面提供了一条重要的运输途径。

4　外泌体传输miRNA的优势与不足

外泌体作为体内小分子的传输载体相对于传统的运输方式有其独特的优势。首先，外泌体来源于内源性细胞，是一种天然的载体，具有良好的免疫原性，从而具有高效和良好的免疫耐受性，用于生物体而不易引起毒性与免疫反应。其次，外泌体直径仅30～100 nm，是一种可以避免被巨噬细胞吞噬的理想的运输miRNA方式，能够将抑癌miRNA或原癌miRNA反义序列特异性运输至靶位点从而调控蛋白表达起到治疗的作用，这种作用方式被称为“exo⁃cure”［33］。故外泌体作为miRNA的运输载体，具有一定的实际应用前景，有助于推动miRNA的基础研究向临床应用转化。但将外泌体作为miRNA载体应用于临床治疗仍存在一些亟待解决的问题。首先如何大批量生产外泌体是制约其进一步应用的关键，目前尚无能够大量生产外泌体的细胞，虽然无限增殖的干细胞可生产用于治疗的外泌体，但这一技术仍然涉及到慢病毒且尚无人源细胞系可用于外泌体的分离，而异源细胞产生的外泌体存在组织相容性问题，安全性不能保证，同时受技术的限制导致外泌体的提取成本非常昂贵。其次，如何能使外泌体特异高效地结合于病灶部位是其真正走向临床应用的另一问题，目前主要通过对外泌体表面蛋白的改造与具有靶向能力的肽段结合使其具有特异性组织结合能力，故外泌体进入体内针对不同组织的的靶向传输miRNA特性仍有待研究。

5　展望

目前，细胞外miRNA已经在各种生理病理条件下被检测到，大量的miRNA可被同时释放，同时调控多个靶点，从而激活一个复杂的网络传导，这些细胞外miRNA来自于细胞自身并稳定存在于外泌体中，被分泌到微环境中并与相应的受体细胞结合后作用于靶点mRNA改变蛋白表达行使生物功能，同时在多种肿瘤患者中发现了一定的表达规律，使其成为近年来新兴的一类肿瘤生物标志物及治疗靶点。随着研究不断深入，外泌体miRNA生物学功能将会进一步得到充实，外泌体介导的小RNA运输系统目前正在被开发并尝试运用到肿瘤的诊断与治疗中。

参考文献

［1］Dong H，Wang C，Lu S，et al.A panel of four decreased serum microRNAs as a novel biomarker for early Parkinson's disease［J］.Biomarkers，2015，21（2）：129-137.

［2］Han Z，Zhang L，Yuan L，et al.Change of plasma microRNA-208 level in acute myocardial infarction patients and its clinical significance ［J］.Ann Transl Med，2015，3（20）：307.

［3］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（30）：10513-10518.

［4］Bar M，Wyman SK，Fritz BR，et al.MicroRNA discovery and profiling in human embryonic stem cells by deep sequencing of small RNA libraries［J］.Stem cells，2008，26（10）：2496-2505.

［5］Pan S，Yang X，Jia Y，et al.Intravenous injection of microvesicle-delivery miR-130b alleviates high-fat diet-induced obesity in C57BL/6 mice through translational repression of PPAR-gamma［J］.J Biomed Sci，2015，16（22）：86.

［6］Li WY，Chen XM，Xiong W，et al.Detection of microvesicle miRNA expression in ALL subtypes and analysis of their functional roles［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2014，34（5）：640-645.

［7］Zhang J，Shan WF，Jin TT，et al.Propofol exerts anti-hepatocellular carcinoma by microvesicle-mediated transfer of miR-142-3p from macrophage to cancer cells［J］.J Transl Med，2014，9（12）：279.

［8］Pan S，Yang X，Jia Y，et al.Microvesicle-shuttled miR-130b reduces fat deposition in recipient primary cultured porcine adipocytes byinhibiting PPAR- g expression［J］.J Cell Physiol，2014，229（5）：631-639.

［9］Hulsmans M，Holvoet P.MicroRNA-containing microvesicles regulating inflammation in association with atherosclerotic disease［J］.Cardiovasc Res，2013，100（1）：7-18.

［10］Pulliam L，Gupta A.Modulation of cellular function through immune-activated exosomes［J］.DNA Cell Biol，2015，34（7）：459-463.

［11］Yuan A，Farber EL，Rapoport AL，et al.Transfer of microRNAs by embryonic stem cell microvesicles［J］.PLoS One，2009，4（3）：e4722.

［12］Wang Y，Fu B，Sun X，et al.Differentially expressed microRNAs in bone marrow mesenchymal stem cell- derived microvesicles in young and older rats and their effect on tumor growth factor-beta1- mediated epithelial- mesenchymal transition in HK2 cells［J］.Stem Cell Res Ther，2015，28（6）：185.

［13］Kambe S，Yoshitake H，Yuge K，et al.Human exosomal placenta-associated miR-517a-3p modulates the expression of PRKG1 mRNA in Jurkat cells［J］.Biol Reprod，2014，91（5）：129.

［14］Li J，Zhang Y，Liu Y，et al.Microvesicle-mediated transfer of microRNA-150 from monocytes to endothelial cells promotes angiogenesis［J］.J Biol Chem，2013，288（32）：23586-23596.

［15］Muralidharan-Chari V，Clancy JW，Sedgwick A，et al.D'Souza-Schorey C.Microvesicles：mediators of extracellular communication during cancer progression［J］.J Cell Sci，2010，123（Pt 10）：1603-1611.

［16］Penfornis P，Vallabhaneni KC，Whitt J，et al.Extracellular vesicles as carriers of microRNA，proteins and lipids in tumor microenvironment［J］.Int J Cancer，2016，138（1）：14-21.

［17］Sharma P，Allison JP.The future of immune checkpoint therapy［J］.Science，2015，348（6230）：56-61.

［18］Li CC，Eaton SA，Young PE，et al.Glioma microvesicles carry selectively packaged coding and non-coding RNAs which alter gene expression in recipient cells［J］.RNA Biol，2013，10（8）：1333-1344.

［19］Shi R，Wang PY，Li XY，et al.Exosomal levels of miRNA-21 from cerebrospinal fluids associated with poor prognosis and tumor recurrence of glioma patients［J］.Oncotarget，2015，6（29）：26971-26981.

［20］Lunavat TR，Cheng L，Kim DK，et al.Small RNA deep sequencing discriminates subsets of extracellular vesicles released by melanoma cells--Evidence of unique microRNA cargos［J］.RNA Biol，2015，12 （8）：810-823.

［21］Munoz JL，Bliss SA，Greco SJ，et al.Delivery of functional anti-miR-9 by mesenchymal stem cell-derived exosomes to glioblastoma multiforme cells conferred chemosensitivity［J］.Mol Ther Nucleic Acids，2013，1（2）：e126.

［22］Ohno S，Takanashi M，Sudo K，et al.Systemically injected exosomes targeted to EGFR deliver antitumor microRNA to breast cancer cells ［J］.Mol Ther，2013，21（1）：185-191.

［23］Munshi SU，Panda H，Holla P，et al.MicroRNA-150 is a potential biomarker of HIV/AIDS disease progression and therapy［J］.PLoS One，2014，9（5）：e95920.

［24］Liu R，Chen X，Du Y，et al.Serum microRNA expression profile as a biomarker in the diagnosis and prognosis of pancreatic cancer［J］.Clin Chem，2012，58（3）：610-618.

［25］Que T，Song Y，Liu Z，et al.Decreased miRNA-637 is an unfavorable prognosis marker and promotes glioma cell growth，migration and invasion via direct targeting Akt1［J］.Oncogene，2015，34（38）：4952-4963.

［26］Chen S，Zhu J，Yu F，et al.Combination of miRNA and RNA functions as potential biomarkers for gastric cancer［J］.Tumour Biol，2015，36 （12）：9909-9918.

［27］Rabinowits G，Gercel-Taylor C，Day JM，et al.Exosomal microRNA：a diagnostic marker for lung cancer［J］.Clin Lung Cancer，2009，10（1）：42-46.

［28］Beach A，Zhang HG，Ratajczak MZ，et al.Exosomes：an overview of biogenesis，composition and role in ovarian cancer［J］.J Ovarian Res，2014，7：14.

［29］Melo SA，Luecke LB，Kahlert C，et al.Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer［J］.Nature，2015，523 （7959）：177-182.

［30］Krutzfeldt J，Rajewsky N，Braich R，et al.Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'［J］.Nature，2005，438（7068）：685-689.

［31］Kota J，Chivukula RR，O'Donnell KA，et al.Therapeutic microRNA delivery suppresses tumorigenesis in a murine liver cancer model［J］.Cell，2009，137（6）：1005-1017.

［32］Cheng CJ，Bahal R，Babar IA，et al.MicroRNA silencing for cancer therapy targeted to the tumour microenvironment［J］.Nature，2015，5189（7537）：107-110.

［33］Kosaka N，Takeshita F，Yoshioka Y，et al.Exosomal tumor-suppressive microRNAs as novel cancer therapy："exocure" is another choice for cancer treatment［J］.Adv Drug Deliv Rev，2013，65（3）：376-382.

（2016-03-25收稿）

（2016-04-28修回）

（编辑：武斌校对：杨红欣）

刘锐专业方向为消化系统肿瘤表观遗传学相关研究。E-mail：liurui9003@163.com

·综述·

Progress on exosomal transmission of microRNAs in cancer research

Rui LIU，Yi BA

Department of Digestive Oncology Internal Medicine，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81201946）

Correspondence to：Yi BA；E-mail：bayi@tjmuch.com

AbstractExosomes are cell-derived vesicles that contain protein and RNA from the same source and function.The vesicle has a diameter between 30 and 100 nm.Exosomes are the natural carriers and have been recently used as drug delivery system for cancer treatment.MicroRNAs（miRNAs）function in RNA silencing and regulation of gene expression.They can exist as intracellular and extracellular miRNAs.Extracellular miRNAs can function as secreted signaling molecules that affect receptor cell phenotype.They can also reflect molecular changes in donor cells.Therefore，extracellular miRNAs can be potentially used for diagnosis and therapeutics.Studies show that the volume of exosomes in cancer patients' blood is higher than that in normal controls.The ability to package cancer-related miRNAs is a biological function of exosomes.In conclusion，specific miRNAs transferred by exosomes may play an important role in the pathogenesis of tumor or cancer.This paper presents a summary of research on exosomes as the carrier of miRNAs in the development and treatment of cancer.

Keywords：microRNA，exosomes，diagnosis，markers，tumor

doi：10.3969/j.issn.1000-8179.2016.10.336

通信作者：巴一bayi@tjmuch.com

作者简介