温和灸对溃疡性结肠炎大鼠天枢穴P2RX7的作用机理研究＊

黄 艳，赵继梦，关 鑫，张建斌，窦传字，施 征，刘慧荣，王晓梅＊＊，吴焕淦＊＊

（1.上海市针灸经络研究所 上海 200030；2.上海中医药大学附属曙光医院 上海 201203；3.南京中医药大学第二临床医学院 南京 210023）

温和灸对溃疡性结肠炎大鼠天枢穴P2RX7的作用机理研究＊

黄 艳1，赵继梦1，关 鑫2，张建斌3，窦传字1，施 征1，刘慧荣1，王晓梅1＊＊，吴焕淦1＊＊

（1.上海市针灸经络研究所 上海 200030；2.上海中医药大学附属曙光医院 上海 201203；3.南京中医药大学第二临床医学院 南京 210023）

目的：溃疡性结肠炎（UC）是艾灸治疗的有效病症，本研究从艾灸作用的始动环节与穴位响应密切相关的角度，探讨温和灸的对穴区P2X嘌呤受体7表达的影响。方法：将20只SD雄性大鼠随机分成正常组6只、模型组14只。采用自由饮用4%葡聚糖硫酸钠（DSS）法建立UC模型，连续饮用7天后，取2只大鼠进行模型鉴定，造模成功后将剩下的12只大鼠随机分成UC组、UC+温和灸组，第8天改为自由饮用1% DSS溶液，第8天开始采用温和灸天枢穴（双）干预7天，每天10 min。疗程结束后，称量大鼠体质量、取双侧天枢穴皮肤，采用HE染色观察病理组织学形态变化，采用免疫组化法对P2RX7的蛋白检测，从分子水平观察温和灸对天枢穴皮肤的作用；采用qRT-PCR的方法检测P2RX7在天枢穴皮肤中的表达。结果：与正常组比较，UC组体质量于第4天开始明显降低（P＜0.05），天枢穴P2RX7基因的mRNA表达水平降低（P＜0.05），天枢穴皮肤中主要分布在真皮层皮脂腺中的P2RX7明显减少（P＜0.05）。与UC组比较，UC+温和灸组在第8天明显增加（P＜0.05），天枢穴P2RX7基因mRNA表达水平增高（P＜0.05），天枢穴皮肤P2RX7主要分布在皮脂腺中的明显增加（P＜0.05）。温和灸干预后所增加体重与天枢穴P2RX7免疫组化IOD值的相关系数r=0.823（P＜0.05）。结论：温和灸能明显增加UC大鼠体重，其起效的机制可能与上调天枢穴位皮肤P2X嘌呤受体7密切相关。

溃疡性结肠炎温和灸天枢穴区P2RX7

艾灸是中国传统医学的经典治疗方法之一，被广泛应用于多个系统疾病的临床防治。穴位是艾灸疗法施灸的重要体表部位，与脏腑经络之气相通，是艾灸发挥作用、取得临床疗效的关键。艾灸作用的始动环节与穴位响应密切相关，研究穴位局部结构与功能是探讨艾灸作用机制的有效切入点[1，2]。本课题前期研究结果提示，溃疡性结肠炎是艾灸疗法的一种有效肠腑病症，艾灸能调节其免疫炎症因子达到抗炎的作用，但其潜在的效应启动机制尚未明确[3，4]。据报道，不同生理病理状态下艾灸足三里穴对穴位局部具有不同的作用效应，其差异性表达基因涉及的通路与嘌呤信号通路密切相关[5]。因此，研究艾灸对穴位的嘌呤信号通路在穴位局部的作用规律及作用特点，为揭示艾灸的作用机制提供重要信息。

溃疡性结肠炎是艾灸的有效病种，以往有研究从穴位局部解剖、局部肥大细胞脱颗粒，辣椒素受体（Transient Receptor Potential Vanilloid，TRPV）等方面对艾灸效应的局部变化进行了深入研究，嘌呤受体是与免疫炎症密切相关的分子[6-10]。研究表明，免疫细胞中表达多种P2X受体，其中P2RX7在免疫反应与炎症中具有重要作用，人单核细胞表达功能性P2RX7，并耦联IL-1β和IL-18释放，参与LPS依赖的免疫细胞激活，ATP通过P2X7引发受LPS处理过的单核/巨噬细胞释放IL-1β和激活核因子NF-κB及MAPK信号系统[11]。本研究以葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS）诱导的溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）作为研究载体，以艾灸双侧天枢穴为干预方式，采用免疫组化、聚合酶链式反应等方法研究艾灸对穴位局部P2RX7的影响，从嘌呤受体角度为艾灸治疗UC提供新的实验资料。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

清洁级雄性SD大鼠20只，体质量200±20 g，由上海中医药大学动物实验中心提供[使用许可SYXK（沪）2009-0069]，动物饲养环境温度在20℃，湿度保持在60%-70%左右，自由进食和饮水，适应性喂养1周后，随机分成2组，正常组6只和模型组14只。每天称量大鼠体重。

1.2 建立大鼠UC模型[12]

给14只UC模型组的大鼠连续自由饮用4% DSS （分子量：36 000-50 000，货号9011-18-1，MP Biomedicals公司，规格：500GM）水溶液7天，取2只大鼠进行模型鉴定，造模成功后将12只大鼠随机分成UC模型组、温和灸组，改为连续自由饮用1% DSS溶液7天维持。

表1 P2RX7及内参GAPDH的引物序列

1.3 艾灸干预措施

温和灸于造模成功后第8天开始介入，提前一天剔除腹部的鼠毛，暴露双侧天枢穴，在距离“天枢穴”2 cm处，每天每穴温和灸10 min，共7天。正常组和UC模型组不干预，给予相同的固定。“天枢穴”根据《实验针灸学》教材定位。艾条规格（大鼠实验专用）：圆柱状，直径7 mm、长120 mm，重量2 g（南阳汉医艾绒有限责任公司）。

1.4 HE染色

采用电脑全自动脱水机进行组织脱水、透明和浸蜡，石蜡切片机进行连续切片厚度为4 μm，二甲苯I、II脱蜡各20 min；100%、95%、85%、75%酒精各3 min；苏木精染色1 min；1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）分色；0.5%水溶性伊红染色5 min；显微镜观察患者肠组织病理形态并评分。

1.5 实时定量PCR

采用Trizol法（美国invitrogen公司，货号：15596026）提取组织总RNA，用Nanodrop超微量分光光度计检测总RNA的浓度及纯度。每个样本取4 mg总RNA用逆转录试剂盒（美国Thermo公司，批号：K1622）逆转录成cDNA，100 ng cDNA模板加200 nM引物采用SYBR Green（德 国QIAGEN公司，货号：204243）在 ABI 7300 型荧光定量 PCR仪（ABI Prism 7300 SDS Software）上扩增。P2RX7mRNA的相对表达量以 2-ΔΔCt表示（ΔCt=目的基因Ct 值－内参基因Ct值）。引物序列如下，见表1：

1.6 免疫组化

采用免疫组织化学Envision法检测。石蜡切片脱蜡至水；20%正常羊血清37℃湿盒孵育30 min，一抗（Rabbit anti-P2RX7，1:100，美国 Sigma公司，货号：AV35518），4℃孵育过夜；加HRP标记二抗（小鼠抗兔）37℃孵育60 min；DAB染色，苏木精复染，0.1%盐酸酒精分化，显微镜下观察；中性树胶封片。每张片子随机选取3个视野，IPP图像分析系统获得统计量阳性积分光密度（Integral Optical Density，IOD）。

1.7 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件，所有计量资料均用均数±标准差表示，符合正态分布的数据采用单因素方差分析比较组间差异，不符合正态分布的数据采用非参数检验，P＜0.05表明差异有统计学意义。符合正态分布的双变量相关分析采用Pearson相关系数r表示，说明具有直线相关的两变量间相关的密切程度与相关方向。

2 结果

2.1 温和灸对UC大鼠的体重评分比较

与正常组比较，UC组的大鼠体重于第4天明显降低，持续到第13天（P＜0.05），提示4%DSS诱导的UC大鼠体重明显降低。与UC组的大鼠体重比较，温和灸组的大鼠体重于第8天开始明显增加，持续到第13天（P＜0.05），提示温和灸有改善UC大鼠体质量的作用。见图1。

图1 3组大鼠体重比较

2.2 温和灸对大鼠的天枢穴皮肤HE染色比较

与正常组比较，UC组大鼠天枢穴皮肤HE染色无明显差异，提示4%DSS并不影响大鼠天枢穴皮肤的形态与结构（P＞0.05）；与UC组比较，温和灸组大鼠天枢穴皮肤HE染色结果提示，细胞形态及大小均无明显差异，提示温和灸不能改变大鼠天枢穴皮肤形态与结构（P＞0.05）。见图2。

图2 3组大鼠天枢穴皮肤的组织形态学比较 (200×)

2.3 温和灸对大鼠天枢穴皮肤P2RX7基因mRNA表达的影响

与正常组比较，UC组的大鼠天枢穴皮肤中基因P2RX7的表达水平明显降低（P＜0.05），提示4%DSS诱导UC后穴位皮肤在mRNA层面上P2RX7表达下调。与UC组比较，温和灸组基因P2RX7的表达水平明显增加（P＜0.05），提示温和灸能在mRNA层面上调P2RX7的表达。见图3。

2.4 温和灸对大鼠天枢穴皮肤P2RX7的免疫组化观察

与正常组比较，UC组的大鼠天枢穴皮肤中P2RX7的表达水平降低，在皮脂腺中表达明显减少（P＜0.05），提示4%DSS诱导的UC大鼠天枢穴位局部P2X嘌呤受体7明显降低。与UC组比较，温和灸组中天枢穴皮肤中P2RX7蛋白的表达水平增加，在皮脂腺中表达明显上升（P＜0.05），提示温和灸能改善因DSS诱导引起的天枢穴皮肤中嘌呤受体P2RX7的表达，其表达水平接近正常组。见图4、图5。

2.5 温和灸增加UC大鼠体重与天枢穴皮肤P2RX7免疫组化IOD值结果的相关性分析

4%DSS诱导的UC大鼠体重较正常组增长减慢，但温和灸天枢穴干预7天后大鼠的体重增长加快。温和灸干预7天后较干预前所增加体重与天枢穴P2RX7免疫组化IOD值呈正相关，Pearson相关性r=0.823（P＜0.05）。见图6。

3 讨论

本研究首次发现4%DSS诱导的大鼠天枢穴区P2RX7表达均降低，温和灸干预天枢穴后局部P2RX7表达均增高，明确了艾灸对穴位局部嘌呤受体P2RX7的表达影响。实验结果显示：温和灸能增加UC大鼠的体重，改善机体的体质量；在mRNA和蛋白层面，温和灸均能上调因4%DSS诱导UC大鼠天枢穴中减少的P2RX7的表达，艾灸疗法促进了P2RX7基因的转录和翻译，尤其在穴位局部真皮层分泌皮脂的皮脂腺中。最新研究发现，大鼠皮脂腺内有神经肽Y、降钙素基因相关肽（CalcitoninGene-Related Peptide，CGRP）等物质，最主要的功能是合成和分泌皮脂，常常以微泡形式分泌包括多种物质的皮脂：甘油三酯、半乳糖、乙酰氨基葡糖、维生素E及抗菌肽等，在脂质微粒表面及内部含有组蛋白H3和Perilipin A蛋白[13]。皮脂腺的分泌常常受温度和雄性激素的调控，皮脂腺在艾灸（温和灸）治疗温度升高时皮脂分泌增加，皮脂腺细胞本身能产生促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropin Releasing Hormone，CRH），通过自分泌、旁分泌方式与CRH受体结合，及与胞内腺苷酸环化酶cAMP作用影响皮脂腺的分泌功能。其功能调节十分复杂，调节炎性细胞因子的表达，参与免疫过程[13]。因此，皮脂腺功能与机体内部神经-内分泌-免疫系统网络间可相互作用，而其中腺苷作为能量直接参与皮脂腺功能的调控，可能与嘌呤受体P2RX7功能密切相关。此外，温和灸干预UC大鼠7天后，增加了其体重，改善了其体质量，其所增体重与温和灸天枢穴引起P2RX7免疫组化的IOD值的直线相关性用散点图（图6）表示，该图提示两变量变化趋势同时增大、趋势相同，为正相关，相关系数r大于0.75（P＜0.05）被认为相关程度较高。

图3 3组大鼠天枢穴皮肤基因P2RX7表达水平比较

图4 3组大鼠天枢穴皮肤P2RX7蛋白表达水平比较

相关研究发现，穴位与非穴位的微量元素不同，在腧穴部位Ca2+浓度明显高于非穴位，并且Ca2+是针刺效应机制的重要环节[7，14]；艾灸后穴位局部细胞外K+浓度增高[1]，可能与艾灸产生的效应机制密切相关，钾离子浓度是始动环节之一，但具体的机制尚不清楚。根据本研究的实验结果，腧穴在针灸后微量元素的变化可能与ATP嘌呤受体P2X密切相关。P2X受体是通过蛋白质构型的改变直接控制内在的离子通道状态的，不需经过膜和胞内信号转导过程，所以反应速度非常快，P2X受体对Na+，K+，Ca2+这样的小阳离子为非选择性通透，导致细胞内Ca2+浓度升高，又可激活电压依赖性Ca2+通道并促进细胞内储存Ca2+的释放，进一步增加细胞内Ca2+浓度，进而使细胞膜去极化。P2RX7可能参与了艾灸后穴位局部小阳离子通道选择性调控[11]。穴位下的血管、小神经束、游离神经末梢或各种特殊感受器等组织结构和针灸的形成密切相关，它们共同构成穴位的感受装置。这些装置在接受到针灸刺激后，穴位下的肥大细胞释放一些活性物质到组织中，包括P物质（SP）及血管活性肠肽（VIP）。神经受到刺激以后，ATP作为共递质参与经典神经递质/神经肽的共同释放。在副交感神经系统，ATP、SP和CGRP共存与神经末梢的大颗粒囊泡中，三者在轴索反射中具有协同作用，而这些物质被认为是穴位后效应的物质基础[15]。

艾灸对UC的效应作用从腧穴局部皮肤开始，经艾灸后的穴位局部皮肤结构与形态并无明显改变，但P2RX7在基因和蛋白层面的表达水平明显增加，且温和灸干预UC大鼠所增加体重与天枢穴P2RX7免疫组化IOD值的呈正相关，其相关程度高。这说明局部的ATP能量发生显著变化，可能是由于艾灸的热刺激作用，激活了穴位表皮下的皮脂腺功能，释放神经肽类物质，而与神经肽共同作用的ATP也被激活，嘌呤受体释放增加，促进了小阳离子通透性改变，P2RX7在艾灸腧穴局部功能中扮演重要的角色。但是，其具体的机制还需要深入研究，有必要结合电生理及膜片钳技术，观察艾灸对穴位局部嘌呤受体、阳离子通道的影响，为艾灸的局部始动作用提供客观的实验室数据。

图5 3组大鼠天枢穴皮肤P2RX7免疫组化定量比较

图6 温和灸增加UC大鼠体重与天枢穴皮肤P2RX7免疫组化IOD值的相关性

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Effect of Warming Moxibustion on P2RX7Regulation in Tianshu Acupoint Skin of Rats with Ulcerative Colitis

Huang Yan1, Zhao Jimeng1, Guan Xin2, Zhang Jianbin3, Dou Chuanzi1, Shi Zheng1, Liu Huirong1, Wang Xiaomei1, Wu Huangan1
(1. Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai 200030, China; 2. Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 3. The Second Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing, 210023, China)

Moxibustion is an effective treatment for ulcerative colitis (UC). Structure and function of acupoints are closely related to the response to moxibustion for patients. This study investigated purinergic receptor P2X7mRNA and protein expressions ofTianshuacupoint under warming moxibustion in UC rats. The 20 male SD rats were randomly divided into two groups: the normal group (n= 6) and the model group (n= 14). The model group rats were fed with 4% dextran sulfate sodium (DSS) for 7 days. Among the 14 rats, 2 rats were taken for identification of successful UC model before moxibustion treatment. The rest of 12 rats in the model group were randomly divided into the UC group, the UC and warming moxibustion group, and fed with 1% DSS solution. On the 8thday, warming moxibustion at bilateralTianshuhad been used in the UC and warming moxibustion group for 7 days, 10 minutes per day. Rats were weighed every day. After 7 days warming moxibustion, theTianshuacupoint skins of both sides were taken for HE staining and immunohistochemistry (IHC). The expression of P2X7onTianshuacupoint skin was detected by qRT-PCR. The results showed that compared with the normal group, the rat body weight decreased from the 4thday in the UC group (P＜0.05); and gene P2RX7expression level also significantly decreased in theTianshuacupoint skin (P＜0.05); P2RX7in the sebaceous glands of the dermis significantly decreased onTianshuacupoint skin (P＜0.05). Compared with the model group, the rat body weight increased from 8thday in the UC and warming moxibustion group (P＜0.05); and gene P2RX7expression level also significantly increased in theTianshuacupoint skin (P＜0.05); P2RX7in the sebaceous glands of the dermis significantly increased onTianshuacupoint skin (P＜0.05). It was positive correlation,r= 0.823(P＜0.05), between the body weight increased by warming moxibustion and the integrated option density (IOD) value of P2RX7 inTianshuacupoint skin in UC. It was concluded that warming moxibustion could significantly increase the body weight of UC rats. The underlying mechanism may be closely related to the upregulation of purinergic receptor P2X7expression inTianshuacupoint skin.

Ulcerative colitis, warming moxibustion,Tianshuacupoint skin, P2RX7

10.11842/wst.2016.03.010

R245

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：王 晶）

2016-02-14

修回日期：2016-03-04

＊ 上海市卫计委科研项目资助（20134013）：艾灸治疗溃疡性结肠炎结肠黏膜炎症相关靶基因调控的机理研究，负责人：吴焕淦；国家重点基础研究发展计划“973计划”项目（2015CB554501）：艾灸效应的启动机制及其内源性调节作用的机理研究，负责人：吴焕淦；国家自然科学基金委面上项目（81574081）：艾灸对结肠炎相关性癌变的ATP-P2X7R的作用及调控机制研究，负责人：吴焕淦；上海中医药大学上海市重点学科资助项目（S30304-A9、S30304-A13）：艾灸烟气安全性的流行病学调查研究，负责人：吴焕淦。

＊＊ 通讯作者：王晓梅，博士，副教授，硕士生导师，主要研究方向：针灸胃肠疾病的临床与基础；吴焕淦，本刊编委，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：针灸作用的基本原理与应用规律研究。