体内抑制库普弗细胞对D-氨基半乳糖所致大鼠肝损伤的影响

刘明颖，杨加彩，王英杰

第三军医大学附属西南医院感染病科, 重庆 400038

论著·肝相关疾病

体内抑制库普弗细胞对D-氨基半乳糖所致大鼠肝损伤的影响

刘明颖，杨加彩，王英杰

第三军医大学附属西南医院感染病科, 重庆 400038

目的观察体内抑制库普弗细胞对D-氨基半乳糖(D-Gal)所致大鼠肝损伤的影响，为急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)的防治研究提供实验依据。方法80只SD实验大鼠随机分为造模对照组和抑制库普弗细胞组，均以D-Gal 10 mg/kg腹腔注射诱导制成ALF模型，抑制库普弗细胞组24 h后经尾静脉按10 mg/kg注入氯化钆。72 h后分别检测造模对照组和抑制库普弗细胞组大鼠的肝功能、炎性因子，1周后切取肝脏组织行光镜及流式细胞凋亡检测。结果抑制库普弗细胞组大鼠血清ALT、AST和TBIL及血清免疫学指标IL-6、IL-1β、TNF-α明显低于造模对照组(P<0.05)；抑制库普弗细胞组大鼠肝脏病变及肝细胞坏死程度显著低于造模对照组；抑制库普弗细胞组存活率显著高于造模对照组(P<0.05)。结论体内抑制库普弗细胞可明显减轻D-Gal所致大鼠的肝损伤，避免或抑制库普弗细胞激活可成为ALF治疗的策略之一。

库普弗细胞；急性肝衰竭；D-氨基半乳糖

库普弗细胞是定居于肝小叶门静脉区的肝窦内的巨噬细胞，占单核巨噬细胞系统的80%～90%，是细胞免疫的重要组成部分，具有吞噬、分泌、免疫调节和监视等生理功能，正常情况下通过库普弗细胞吞噬外源颗粒起到保护肝细胞的作用，库普弗细胞被激活时就释放大量促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β)、氧自由基等，引起肝细胞损伤[1-3],以往有关化学药物如D-氨基半乳糖(D-Gal)所致的大鼠肝损伤研究中，多集中在血清学、病理指标等的观察上，鲜有通过抑制库普弗细胞的方式研究肝脏病理损伤程度及肝细胞坏死程度的报道。本研究采用氯化钆(gadolinium chloride, GdCl3)体内抑制库普弗细胞的方法，观察了D-Gal诱导的急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)模型鼠中抑制库普弗细胞对大鼠血清学指标、肝组织病理、肝细胞凋亡的影响，以期进一步阐明库普弗细胞在ALF的作用与意义。

1 材料与方法

1.1 动物分组与建模雌性SD大鼠80只，普通级，由第三军医大学实验动物中心提供。质量100～120 g，普通饲料喂养，自由饮水。实验大鼠随机分为两组(每组40只)，即：造模对照组、抑制库普弗细胞组(KC抑制组)。两组大鼠均以D-Gal 10 mg/kg腹腔注射诱导制备急性肝衰竭模型，KC抑制组24 h再经尾静脉按10 mg/kg注入氯化钆(sigma)。

1.2 生化指标的观察72 h后采集两组实验大鼠尾静脉血，12 000 r/min离心15 min取血清，生化分析仪(Picollo-Abaxis)检测血清ALT、AST和TBIL。

1.3 炎性因子的观察72 h后采集两组实验大鼠尾静脉血，12 000 r/min离心15 min取血清，用ELISA法(试剂盒购自深圳达科为生物技术公司)测定大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α，具体操作按试剂说明书进行。

1.4 大鼠存活率、病理和肝细胞凋亡的观察模型建立后观察1周内大鼠的存活率，1周后随机对存活大鼠肝组织进行HE染色观察，同时切取肝组织运用Annexin V-FITC法(碧云天)流式细胞术检测肝细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 大鼠生化指标及细胞因子水平的变化D-Gal腹腔注射大鼠诱导制成ALF模型72 h后，KC抑制组大鼠各血清指标(ALT、AST、TBIL)明显低于模型对照组大鼠(P<0.05)，说明抑制库普弗细胞后大鼠肝功能损伤减轻，肝功能明显改善。同时大鼠各血清免疫反应指标(IL-6、IL-1β、TNF-α)明显低于模型对照组(P<0.05)，说明抑制库普弗细胞后大鼠肝免疫反应较模型对照组轻，肝功能损伤较轻(见表1)。

组别ALT(IU/L)AST(IU/L)TBIL(μmol/L)IL-6(pg/ml)IL-1β(pg/ml)TNF-α(pg/ml)模型对照组2145.00±295.861602.31±233.0822.06±7.713800.85±1473.622122.47±180.981128.03±33.07KC抑制组181.67±71.18*516.67±124.63*1.81±0.82*624.26±172.68*1288.64±75.43*217.30±117.16*

注：与模型对照组比较，*P<0.05。

2.2 肝脏病理特点及流式细胞检测D-Gal腹腔注射后1周取肝组织HE染色观察，模型对照组肝细胞重度水肿、嗜酸性变，细胞排列紊乱，细胞核裂解，汇管区淋巴细胞及浆细胞浸润并出现空洞(见图1A)。KC抑制组仅见灶区肝细胞轻度水肿，汇管区淋巴细胞及浆细胞浸润较模型对照组轻，未出现明显空洞(见图1B)。流式细胞仪检测结果显示模型对照组肝细胞凋亡数量为(3285±176)个，占检测肝细胞总数的(6.57±0.35)%，KC抑制组肝细胞凋亡数量为(1625±124)个， 占检测肝细胞总数的(3.25±0.25)%，凋亡数量明显少于模型对照组(P<0.05，见图2)。

2.3 实验大鼠的一般生存情况与存活率腹腔注射D-Gal后，模型对照组大鼠出现反应迟钝、活动减少、食欲减低、部分毛发蓬乱。KC抑制组活动自如，大部分正常饮食，1周后模型对照组存活率8.33%，KC抑制组存活率40%，与模型对照组比较，KC抑制组存活率更高(P<0.05)(见图3)。

图1 D-gal诱导大鼠ALF 7 d肝组织肝脏病理(HE染色 40×)A：模型对照组；B：KC抑制组；图2 流式细胞检查A：模型对照组；B：KC抑制组

Fig 1 Histological changes of liver tissue in ALF rats at 7 d after treatment (HE 40×)A: model control group; B: KC inhibition group;Fig 2 Flow cytometry

A: model control group; B: KC inhibition group

3 讨论

GdCl3是库普弗细胞特异性抑制剂，GdCl3可抑制库普弗细胞的吞噬功能，影响细胞表面蛋白的表达，还可直接诱导库普弗细胞凋亡，从而全面抑制库普弗细胞的功能[4-5]。因此，应用GdCl3抑制库普弗细胞功能与活性，将有助于ALF发病机制与防治的深入研究。

图3 模型对照组和KC抑制组大鼠的存活率

Fig 3 Survival rate of model control group and KC inhibition group

曾有研究显示肝损伤的动物模型中用GdCl3灭活库普弗细胞后,大鼠血浆ALT、AST的水平显著下降，而未用GdCl3处理的大鼠血浆ALT、AST的水平显著升高，伴有明显的肝脏病理改变[6]。由于库普弗细胞对机体的免疫调节作用是通过一系列的前炎症因子产生的[7]，有实验进一步显示肝损伤的动物模型中大鼠血浆库普弗细胞表达的前炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-1和IL-6等水平比对照组大鼠高数倍[5,8]。我们的实验结果显示，D-氨基半乳糖构造大鼠ALF模型72 h后，大鼠血清ALT、AST、TBIL的值远高于正常值，而GdCl3灭活库普弗细胞后大鼠血浆ALT、AST、TBIL的值与模型对照组比较差异有统计学意义。灭活库普弗细胞后TNF-α、IL-1β和IL-6值与模型对照组比较，差异有统计学意义。我们认为此种现象是造模后24 h内肝损伤引起转氨酶升高及库普弗细胞活化，从而引起库普弗细胞表达的前炎症因子升高，进而引起肝细胞进一步损伤，其血清酶水平和炎症因子水平进一步升高。 当库普弗细胞被GdCl3灭活(24 h)后, 肝细胞进一步损伤便停止，其血清酶水平和炎症因子便停留在24 h水平，而低于模型对照组。

肝脏病理结果显示，造模72 h后，模型对照组大鼠肝细胞出现肿胀， 空泡变性， 汇管区有大量炎性细胞浸润，肝细胞出现灶状坏死,肝组织有裂解现象。而

CK抑制组大鼠肝组织汇管区有少许炎性细胞浸润， 肝细胞基本保持完整，灶状坏死较少。流式细胞术检测肝细胞凋亡，模型对照组肝细胞坏死的比例高达6.57%，而CK抑制组为3.25%，差异有统计学意义。充分说明库普弗细胞的灭活在保护ALF大鼠肝功能方面有重要作用。

综上，本实验所得结果与以往药物肝损伤时血清学及炎性细胞因子变化相吻合，进一步运用肝脏病理、流式细胞凋亡及动物存活率方面的数据证实，库普弗细胞的灭活在保护ALF大鼠肝功能的方面有作用，再次证明库普弗细胞在ALF的发生机制中起着重要作用，抑制普弗细胞减轻肝损伤为肝衰竭防治策略的探讨提供了新的依据。

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(责任编辑：王全楚)

The effects of inhibiting Kupffer cells on the liver function of acute liver failure rats caused by dgalactosamine

LIU Mingying, YANG Jiacai, WANG Yingjie

Institute of Infectious Disease, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

Objective To study the effects of inhibiting Kupffer cells on the liver function of acute liver failure (ALF) rats caused by dgalactosamine (D-Gal), and then provide experimental evidence for the treatment of ALF in clinical application.Methods Eighty rats were randomly divided into 2 groups: model control group (N group) and gadolinium chloride (GdCl3) group ( KC group), 10 mg/kg of D-Gal were intraperitoneally injected into both groups, 10 mg/kg of GdCl3were injected through caudal vein for KC group. Liver serologies, liver histology were examined at 72 hours after the injection of D-Gal, survival benefits were calculated at 7 days after the injection of D-Gal.Results The levels of ALT, AST and TBIL in rat serum in KC group were significantly lower than those in model control group. Inflammatory responses in KC group was also significantly lower than that in model control group. Liver histology changes and survival benefits also supported this phenomenon.Conclusion The inhibition of Kupffer cells can significantly improve liver function of ALF rats.

Kupffer cells; Acute liver failure; Dgalactosamine

刘明颖，硕士研究生，研究方向：急性肝衰竭的治疗。E-mail: kakarye@163.com

王英杰，医学博士，教授，主任医师，博士生导师。E-mail: yingjiewang126@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.09.010

R575

A 文章编号：1006-5709(2016)09-1002-03

2015-12-08