中性粒细胞弹性蛋白酶对HepG2细胞增殖的影响及其机制的研究

夏天放，徐 果

江苏省淮安市第一人民医院普外科，江苏 淮安 223300

中性粒细胞弹性蛋白酶对HepG2细胞增殖的影响及其机制的研究

夏天放，徐 果

江苏省淮安市第一人民医院普外科，江苏 淮安 223300

目的研究中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)对HepG2细胞增殖的影响及其相关机制。方法设定不同浓度的NE在不同时间内作用于HepG2细胞，利用CCK-8法检测细胞增殖情况；用流式细胞仪技术(flow cytometry，FCM)分析特定浓度下NE对细胞凋亡率的影响；Western blotting法检测NE与HepG2细胞内PI3K/AKT信号通路活化状态的关系；激光共聚焦法检测NE是否通过内涵体途径进入细胞内发挥作用。结果不同浓度的NE(20 nmol/L、40 nmol/L)作用细胞于不同的时间点(6 h、12 h、24 h、48 h)，CCK-8法检测细胞存活率，发现NE可以促进细胞增殖，两者之间有明显的剂量效应关系(P<0.01)和时间效应关系(P<0.05)；与HepG2细胞相比，NE/HepG2细胞经过15 μmol/L丝裂霉素(MMC)处理后，FCM检测凋亡率由(39.7±2.3)%降至(15.7±1.5)%(P<0.01)；20 nmol/L NE、40 nmol/L NE分别处理细胞HepG2(NE/HepG2组)后p-AKT的水平显著提高(P<0.05)，且实验组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；10 μmol/L ly294002、10 μmol/L ly294002+40 nmol/L NE分别处理细胞HepG2后p-AKT的水平明显降低(P<0.05)，但实验组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；激光共聚焦实验表明NE可以通过内吞作用进入细胞内，且主要位于胞内靠胞膜侧，在应用细胞内吞作用抑制剂DYNASORE后，进入细胞内NE明显减少。结论NE对HepG2细胞增殖有促进作用，呈显著的剂量效应关系和时间效应关系，这一促进作用是通过NE进入肝癌细胞内增强信号通路PI3K/AKT中p-AKT的表达实现的。

中性粒细胞弹性蛋白酶；细胞增殖；PI3K/AKT；内吞作用

中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)是中性粒细胞释放的诸多蛋白酶中最重要的一种。NE与恶性肿瘤关系密切，目前已在包括肺癌、乳腺癌在内的多种常见恶性肿瘤中发现有NE的高水平存在，并与肿瘤预后相关[1]，以往研究显示NE在肿瘤中可通过降解细胞外基质、激活金属蛋白酶，从而破坏肿瘤基质和微血管，促进肿瘤的侵袭和转移。也有文献报道，NE可以刺激生长因子VEGF、PDGF的释放[2-3]，也有研究显示NE可上调PI3K/AKT通路的活化，从而刺激肿瘤细胞的增殖[4]，目前NE对肿瘤细胞增殖与凋亡直接作用的具体机制尚未完全明确。本实验通过细胞增殖实验，流式细胞仪技术(flow cytometry，FCM)研究NE对肝癌细胞增殖的影响，通过Western blotting研究NE与细胞信号转导通路PI3K/AKT的相关性，激光共聚焦法验证NE是否通过内吞作用进入细胞发挥作用，初步探讨NE在肝癌细胞中的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂NE购于ENZO公司，保存于-20 ℃，人肝癌细胞系HepG2由湖北省华中科技大学同济医院肝病研究所提供，DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰酶溶解液皆购自杭州四季青公司，CCK-8试剂盒、Annexin v-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自联科生物公司，RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，凝胶配制试剂盒购自博士德公司，兔抗AKT、PAKT(Ser473)、β-Actin、Marker购自CST公司，二抗HRP 标记羊抗兔IgG、化学发光(ECL)底物购自Santa Cruz 公司；Dynasore hydrate 购自Sigma公司，FITC-Mouse Anti-Human EEA1、Goat Anti-Rabbit PEcy5.5、DAPI染核剂购自BD公司，兔抗NE抗体购自abcam公司。

1.2 方法

1.2.2 细胞凋亡分析：收集对数生长期细胞，调整浓度，1×106/孔接种于6孔培养板中生长12 h，设立对照组，实验组加入NE使终浓度为40 nmol/L，每组设3复孔，继续生长12 h后加入丝裂霉素(MMC，终浓度15 μg/ml)，6 h后收集细胞1×106每管，PBA洗涤2次，加入500 μl 1×binding buffer,混匀后加入5 μl FITC和10 μl PI，室温避光5 min，FACSort流式细胞仪(美国BD公司)检测凋亡率，数据采用Winmdi软件分析，实验重复3次。

1.2.3 蛋白提取与Western blotting：收集对数生长期细胞，调整浓度，1×106/孔接种于6孔培养板中生长12 h，分别加入NE，终浓度为0 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L及10 μmol/L ly294002、10 μmol/L ly294002+40 nmol/L NE作用12 h后收集细胞，计数后用冰PBS洗涤2遍，去上清加入适量裂解液，冰上放置30 min，13 000 r/min离心5 min后去上清，采用Braford法测定蛋白浓度，电泳前加入4×SDS缓冲液，100 ℃水浴5 min，取65 μg蛋白行12%SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳，蛋白分离后，电泳转至硝酸纤维素膜，室温下封闭2 h，一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，二抗(1∶8 000)室温在反应2 h，采用增强化学发光法(ECL)显影，暗室压片，胶片结果经UVP公司GDS8000型凝胶成像分析系统分析处理数据，计算灰度殖，以β-肌肉蛋白为内参照。

1.2.4 激光共聚焦实验：收集对数生长期细胞，1×106/皿继续孵育12 h，实验组1加入Dynasore 40 μmol/L，作用1 h后加入NE 40 nmol/L，同时向实验组2加入NE 40 nmol/L，作用30 min后弃去培养基，加入PBS洗涤3次，各皿中加入3%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，加入0.1%Triton-X100室温下固定5 min，PBS洗涤后加入山羊血清(10%)37 ℃封闭30 min，去封闭液加入一抗工作液(NE抗体1∶200)4 ℃过夜，倒去一抗工作液后加入PBS洗涤3次，加入二抗工作液(DAPI，FITH-EEA1，PECY5.5稀释浓度皆为1∶200)后37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次后共聚焦镜下(LEICA，美国BD公司)观察拍照。

1.3 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件包分析所得数据，进行方差分析及t检验，P<0.05认为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8法检测显示NE可以促进细胞增殖(1)剂量效应关系：分别比较各个时间点(6 h、12 h、24 h、48 h)细胞存活率发现，20 nmol/L与40 nmol/L的存活率与对照组相比差异具有显著统计学意义(P<0.01)，两组浓度组之间比较差异具有显著统计学意义(P<0.01，见表1、图1)；(2)时间效应关系：20 nmol/L作用6 h、12 h、24 h、48 h后的细胞存活率两两比较，除24 h与48 h(P=0.085)比较差异无统计学意义外，其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，40 nmol/L作用6 h、12 h、24 h、48 h后的细胞存活率两两比较，除24 h与48 h(P=0.293)比较差异无统计学意义外，其他各组差异均有统计学意义(P<0.05，见表1、图2)。

药物浓度细胞存活率6h12h24h48h20nmol/L1.27±0.01*#1.61±0.03*#1.81±0.02*1.94±0.02*40nmol/L1.59±0.03*#1.98±0.02*#2.17±0.03*2.25±0.01*

注：同时间点与其他实验组比较，*P<0.01；同浓度下与其他实验组比较，#P<0.05。

图1 不同浓度NE对HepG2细胞增殖的影响(剂量效应关系)

Fig 1 The effect of different concentrations of NE on proliferation of HepG2 cells (dose-dependent)

图2 不同浓度NE对HepG2细胞增殖的影响(时间效应关系)

Fig 2 The effect of different concentrations of NE on proliferation of HepG2 cells (time-dependent)

2.2 流式细胞仪分析细胞凋亡表明NE可以减少细胞的凋亡从而促进细胞增殖同时经15 μmol/L的丝裂霉素(MMC)作用6 h，HepG2细胞凋亡率为(39.7±2.3)%；而NE处理过HepG2(NE/HepG2)细胞凋亡率降至(15.7±1.5)%，两者比较差异有明显的统计学意义(t=14.76，P<0.01，见图3)。

2.3 NE可以上调PI3K/AKT通路中的PAKT水平Western blotting结果表明，20 nmol/L NE作用细胞后，p-AKT水平提高了40%(t=15.71，P<0.01)，40 nmol/L NE作用细胞后p-AKT水平提高了71%(t=22.41，P<0.01)，两个不同浓度组间p-AKT水平差异也存在明显统计学意义(t=9.89，P<0.01)，而10 μmol/Lly294002作用细胞后p-AKT水平降低(t=20.54，P<0.01)、10 μmol/L ly294002+40 nmol/L NE作用于细胞后p-AKT水平降低(t=24.17，P<0.01)，但两组p-AKT水平差异无统计学意义(P>0.05，见图4)。

2.4 NE通过内吞作用进入细胞内发挥作用共聚焦显微镜下观察，NE与初级内吞小体抗原EEA1结合进入细胞，在胞内靠细胞膜附近有明显的结合现象，在应用内吞抑制剂Dynasore后，结合现象明显减弱，进一步证明NE进入细胞内的路径是通过内吞实现的(见图5)。

图3 FCM仪检测细胞在丝裂霉素(MMC，15 μmol/L)作用6 h时的凋亡率AP

A：HepG2对照(AP：3.15%)；B：HepG2+MMC(AP：39.04%)；C：NE/HepG2+MMC(AP：15.13%)

Fig 3 FCM analyzed the cells apoptosis under MMC(15 μmol/L)for 6 h

A：controlled HepG2(AP：3.15%)；B：HepG2+MMC(AP：39.04%)；C：NE/HepG2+MMC(AP：15.13%)

图4 NE、ly294002、ly294002+NE处理HepG2细胞后p-AKT、AKT的表达Fig 4 The p-AKT levels after NE，ly294002, ly294002+NE treated cells(Western blotting)

图5 NE在HepG2细胞中的定位(激光共聚焦：红色-PECY5.5标记NE；绿色-FITH标记内吞小体；核Dapi蓝染)

A:HepG2; b:NE/HepG2; c:NE/HepG2； d：dynasore18-NE/HepG2; e：dynasore18-NE/HepG2

Fig 5 The location of NE in cells (confocal laser：Red-PECY5.5 marked NE; Green-FITH marked endosome；Blue-cell nucleus)

a:HepG2; b:NE/HepG2; c:NE/HepG2; d:dynasore18-NE/HepG2; e:dynasore18-NE/HepG2

3 讨论

NE是一种主要由活化的中性粒细胞分泌的水解蛋白酶，其编码基因为Elane，分子量为30 kD。通常中性粒细胞释放的NE不超过其总量的2%[5]，NE的转录与合成主要在幼稚细胞阶段，被严格地控制在中性粒细胞嗜苯胺蓝体的颗粒内,在机体急性感染、炎症、组织损伤或坏死、急性溶血和失血、急性中毒及恶性肿瘤等情况时中性粒细胞激活并发生脱颗粒作用，NE被释放至细胞外，经过多种内源性蛋白酶抑制剂的调控进而发挥重要作用[6-7]。

多种恶性肿瘤的发生和转移中发现有高水平的NE参与，关于NE如何参与肿瘤发生和调控的途径，目前尚无定论。笔者关注到已有体外实验发现中性粒细胞可增强肝癌细胞的侵袭能力[8]；且研究显示作为细胞内NE最主要的抑制剂α1抗胰蛋白酶的缺陷与肝癌的发生相关[9]。为了探讨NE与肝癌细胞的关系，我们在体外实验中采用CCK-8法检测NE对细胞增殖影响：NE可很大程度地促进细胞的增殖，且这种促进作用表现出一定的剂量效应关系和时间效应关系；进一步FCM分析经过NE可以使肝癌细胞在受到化疗药物丝裂霉素杀伤后的凋亡率明显降低，两组实验都说明NE对肝癌细胞的促进作用。

NE作为分泌型蛋白酶，肿瘤细胞膜表面不存在NE受体；并且NE并未发现带有磷酸化位点，使其无法成为信号转导分子，因此NE对胞内信号通路的影响机制可能有：(1)在细胞膜上干预生长因子配-受体结合；(2)进入细胞内作用于胞内信号分子，影响其功能。结合Houghton等[4]的研究结果，我们认为NE可能有位于细胞内的作用靶点，且其靶蛋白的功能改变将可直接影响某个通路中重要信号分子的活化水平，从而影响肿瘤细胞的行为。

PI3K/AKT是与细胞增殖和细胞凋亡关系最密切的信号转导通路[10-12]，活化的AKT可磷酸化其多个下游底物如Bad、Forkhead家族转录因子(FKH-TFs)、NF-κB、Mdm2等而抑制细胞凋亡，对肿瘤细胞的生物学行为具有重要意义[13-16]，因此我们选择这条信号通路作为NE的潜在作用靶点进行研究并观察其生物效应。通过Western blotting发现NE可以明显提高肝癌细胞PAKT蛋白的活化水平，说明NE与PI3K/AKT这一信号通路密切相关，进一步在共聚焦显微镜下观察NE通过内吞作用进入细胞内并聚集于胞内靠膜侧发挥作用，NE在细胞内具体作用靶点的确定及NE抑制剂在体内实验中的效果如何将在后续研究加以探索，本次结果不仅证明了NE对肝癌细胞增殖有促进作用，同时将细胞外的蛋白酶与细胞内的信号通路联系起来，提出NE可以直接进入细胞内实现靶点结合发挥效应，这一结果有助于肝癌生物学特性的进一步研究，目前，弹性蛋白酶抑制剂治疗急性肺损伤及肺部炎症已经在临床上取得显著效果[17-18]，随着本研究的进一步开展及NE抑制剂的开发应用，将为肝癌治疗的新策略提供思路和理论基础。

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(责任编辑：马 军)

The mechanism and effect of neutrophil elastase on proliferation of HepG2 cells

XIA Tianfang, XU Guo

Department of General Surgery, Huai’an First People’s Hospital of Jiangsu Province, Huai’an 223300, China

Objective To investigate the effect of neutrophil elastase (NE) on proliferation of HepG2 cells, as well as to explore its mechanism.Methods The effect of NE on HepG2 cells was tested with various concentrations of NE treatment for different time by CCK-8 assay; flow cytometry (FCM) was used to analyze the cells apoptosis under certain concentration, the relationship between NE and the PI3K/AKT signaling pathway was detected by Western blotting, confocal laser method detected if NE entered the cell by endocytosis. Results After different concentrations of NE (20 nmol/L,40 nmol/L) effected the cells at different time points (6 h，12 h，24 h，48 h), CCK-8 assay showed NE can promote the proliferation in a significant dose-depentdent (P<0.01) and a time-dependent manner (P<0.05). Compared with HepG2 cells, when the NE/HepG2 cells were treated by 15 μg/ml mitomycin, the significant apoptosis rate dropped from (39.7±2.3)% to (15.7±1.5)%; after different concentrations of NE(20 nmol/L, 40 nmol/L) treated cells, p-AKT levels were increased significantly (P<0.05), while 10 μmol/L ly294002, 10 μmol/L ly294002+40 nmol/L NE treated cells, p-AKT levels were decreased significantly (P<0.05); confocal images showed that NE entered cells by endocytosis to play a role, after the application of endocytosis inhibitors DYNASORE, NE in the cells was significantly decreased.Conclusion NE can promote human HepG2 cell proliferation in a dose-dependent and a time-dependent manner, this effect is achieved by entering the cells with endocytosis and enhancing the signal expression of p-AKT.

Neutrophil elastase; Cell proliferation; PI3K/AKT; Endocytosis

夏天放，在职博士，主治医师，研究方向：肝胆病学分子机制。E-mail：xiatianfang@126.com

徐果，副主任医师，研究方向：肝胆病学分子机制。E-mail:xg1167@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.09.012

R735.7

A 文章编号：1006-5709(2016)09-1009-05

2015-12-17