一株红树林真菌Alternariasp.R6固相培养代谢产物研究*

2016-06-05周丹丽祝钧杰冯子昊邱远昆佘志刚李春远

中山大学学报(自然科学版)(中英文) 2016年3期

陈敏,周丹丽,祝钧杰,冯子昊,邱远昆,佘志刚,李春远

(1.华南农业大学公共基础课实验教学中心，广东广州 510642；2.华南农业大学材料与能源学院，广东广州 510642；3.中山大学化学与化学工程学院，广东广州 510275)

陈敏1,周丹丽2,祝钧杰2,冯子昊2,邱远昆2,佘志刚3,李春远2

研究红树林真菌Alternariasp. R6固相培养代谢产物，用硅胶和Sephadex LH-20柱层析手段从甲醇提取物分离单体，波谱技术鉴定结构，二倍稀释法测试抗菌活性。分离到(4R,5R)-4,5-二羟基-3-甲氧基-5-甲基-环己-2-烯-1-酮 (1)，(4R,5S,6R)-4,5,6-三羟基-3-甲氧基-5-甲基-环己-2-烯-1-酮 (2)，xylariacyclone B (3)， (4S,5S,6S)-5,6-环氧-4-羟基-3-甲氧基-5-甲基-环己-2-烯-1-酮 (4)，LL-C10037α (5)，1-羟基-8-(羟甲基)-6-甲氧基-3-甲基-9H-呫吨-9-酮 (6),6-甲基-1-甲氧羰基-8-羟基呫吨-9-酮 (7)，6-羧基-1-甲氧羰基-2,8-二羟基呫吨-9-酮 (8)，麦角甾醇和过氧化麦角甾醇共10个化合物。化合物1,2,3,4,5,6和8为首次从Alternaria属分离到。化合物6和8对小麦赤霉、香蕉炭疽，化合物2对香蕉炭疽显示良好抗菌活性。

红树内生真菌；Alternariasp.；呫吨酮；环己烯酮；抗真菌活性

海洋红树林微生物已成为寻找新药先导物的重要资源[1-3]。Alternariasp.分布广泛，属于子囊菌亚门，其某些种是引起作物腐败的植物病原菌[4]。内生真菌Alternariasp. R6采集自湛江沿海半红树植物苦槛蓝根部，在液体培养时不显示抗菌活性[5]，我们从中分离到了具有抗肿瘤活性的二苯乙烯新化合物[6]。该菌在固体大米培养时对多种植物病原菌显示较强抗菌作用，我们又获得了多个有抗菌及抗氧化活性的新化合物[7]。本文继续研究该菌固相培养代谢产物，共分离鉴定了10种化合物，分别为(4R,5R)-4,5-二羟基-3-甲氧基-5-甲基-环己-2-烯-1-酮(1)，(4R,5S,6R)-4,5,6-三羟基-3-甲氧基-5-甲基-环己-2-烯-1-酮(2)，xylariacyclone B (3)， (4S,5S,6S)-5,6-环氧-4-羟基-3-甲氧基-5-甲基-环己-2-烯-1-酮(4)，LL-C10037α(5)，1-羟基-8-(羟甲基)-6-甲氧基-3-甲基-9H-呫吨-9-酮(6),6-甲基-1-甲氧羰基-8-羟基呫吨-9-酮(7)，6-羧基-1-甲氧羰基-2,8-二羟基呫吨-9-酮(8)，麦角甾醇和过氧化麦角甾醇，其中化合物1，2，3，4，5，6和8为首次从Alternaria属真菌中分离到。活性测试表明，化合物6和8对香蕉炭疽Colletotrichummusae(Berk. & M. A. Curtis) Arx和小麦赤霉FusariumgraminearumSchw.，化合物2对香蕉炭疽显示良好抗菌活性。

1 结果与讨论

化合物1的1H NMR显示1个甲基δ1.23(3H,s),1个CH2δ2.53(1H,d,16.0 Hz ),2.59(1H,d,16.0 Hz),1个甲氧基3.69 (3H,s),1个双键5.20 (1H,s)，2个羟基(滴加重水后消失)3.71(1H,br s),4.77 (1H,d,5.4 Hz)及1个与羟基4.77 (1H,d,5.4 Hz)相连的CH信号4.08 (1H,d,5.4 Hz)。13C NMR显示8个碳，其中δ196.8为羰基信号，102.4为双键碳，因此另一个双键碳化学位移为176.3，鉴于其数值偏高，判断该双键与羰基共轭，且δ176.3的双键碳与甲氧基相连。剩余的碳根据化学位移值判断δ74.3，72.8的碳均连有羟基，57.0,49.3,26.3则分别为甲氧基，亚甲基和甲基碳的信号。进一步结合EIMSm/z: 172 [M]+给出的相对分子质量，确定化合物分子式为C8H12O4，除去双键和羰基的不饱和度，表明化合物1是取代有上述基团的环己-2-烯-1-酮衍生物。在此基础上与文献[8]对照波谱数据及比旋光度数值基本一致，鉴定化合物1为(4R,5R)-4,5-二羟基-3-甲氧基-5-甲基-环己-2-烯-1-酮。

化合物2的EIMS显示其相对分子质量比化合物1多16，两者的1H NMR和13C NMR谱类似，表明具有类似的分子骨架，仔细对比二者核磁数据，发现与化合物1相比，化合物2的1H NMR中多出δ4.43(1H,m) 的连羟基CH信号，且多出1个羟基信号，同时没有了CH2上两个H的信号，表明化合物2是在化合物1的亚甲基位置取代了1个羟基的衍生物。在此基础上与文献[8]波谱数据和比旋光度对照基本一致，鉴定为(4R,5S,6R)-4,5,6-三羟基-3-甲氧基-5-甲基-环己-2-烯-1-酮。

化合物3的核磁共振谱与化合物2类似，其1H NMR在化学位移2.27 (3H,s)多出了1个甲基，同时少了1个羟基信号。13C NMR谱在δ171.2处多出了1个酯碳基信号，进一步结合ESIMSm/z: 231 [M+H]+给出的相对分子质量，表明化合物3是化合物2中的1个羟基发生了乙酰化后的产物，在此基础上与文献[9]对照波谱数据及比旋光度数值基本一致，鉴定为xylariacyclone B。

化合物4 的核磁共振谱与化合物2类似，仔细对比化合物4和2的1H NMR，发现化合物4比化合物2少了2个羟基，其EIMSm/z: 170 [M]+与化合物比少了18，同时其13C NMR与化合物2比变化不大，因此化合物4可能是化合物2中两个羟基脱去1分子水形成的衍生物，在此基础上与文献[8]波谱数据和比旋光度数据对照基本一致，化合物4鉴定为(4S,5S,6S)-5,6-环氧-4-羟基-3-甲氧基-5-甲基-环己-2-烯-1-酮。

化合物5的核磁共振谱与化合物4类似，与化合物4相比，其1H NMR没有了甲氧基和δ1.52附近的甲基信号，同时出现了δ2.04 (3H,s)的甲基和9.04(1H,br s)的酰胺活泼H信号，因此化合物5可能是化合物4去掉甲基和甲氧基，并多取代上1个乙酰胺基的衍生物。在此基础上与文献[10,11]对照波谱数据及比旋光度基本一致，化合物5鉴定为LL-C10037α。

化合物6 的HRESI-MSm/z: 286.0838 [M]+显示分子式为C16H14O5，1H NMRδ6.62(1H,d,1.8 Hz)和 6.70(1H,d,1.8 Hz),6.80(1H,d,2.4 Hz)和6.89(1H,,d,2.4 Hz)分别为两组互为间位的芳香H，表明分子中有两个苯环。13C NMR中δ183.0是与两个苯环共轭的羰基。分子中剩余的不饱和度表明化合物除了两个苯环外还应有一个环状结构，由此推断化合物6可能具有呫吨-9-酮的骨架。1H NMR中δ2.43 (3H,s)和3.94(3H,s),4.93(2H,s)表明苯环上取代有甲基，甲氧基，羟甲基，12.63(1H,s)的高尖峰是与羰基形成分子内氢键的羟基信号，上述推断与化合物分子式相符合。在此基础上进一步与文献[12]波谱数据对照基本一致，化合物6鉴定为1-羟基-8-(羟甲基)-6-甲氧基-3-甲基-9H-呫吨-9-酮。

化合物7的1H NMR和13C NMR显示与化合物6类似的特征，表明同样具有呫吨-9-酮的骨架。1H NMRδ7.74(1H,t,8.4,7.2 Hz),7.53(1H,d,8.4,1.2 Hz),7.31(1H,d,7.2,1.2 Hz)是苯环上互为邻位的3个H，6.76(1H,,d,1.2 Hz),6.64(1H,d,1.2 Hz)是另一个苯环的两个互为间位的H，12.15(1H,s)是与羰基形成分子内氢键的羟基,4.03(3H,s)和2.44(3H,s)分别是甲氧基和甲基。由于13C NMR存在δ169.6的酯羰基信号，因此上述甲氧基是取代在苯环上的甲氧羰基的一部分。在此基础上进一步与文献[13]波谱数据对照基本一致，化合物7鉴定为6-甲基-1-甲氧羰基-8-羟基呫吨-9-酮。

化合物8的1H NMR和13C NMR与化合物6对比，表明同样具有呫吨-9-酮的骨架。1H NMRδ7.67 (1H,d,9.0 Hz),7.53 (1H,d,9.0 Hz)是苯环上互为邻位的H，7.48 (1H,d,1.2 Hz),7.20 (1H,d,1.2 Hz)是另一个苯环上互为间位的H，δ12.21 (1H,s) 是与羰基形成分子内氢键的羟基，1H NMRδ3.86 (3H,s)结合13C NMRδ166.6 表明分子中有1个甲氧羰基，1H NMRδ10.71 (1H,s) 结合13C NMRδ165.8 表明分子中存在1个羧基，剩余的相对分子质量表明分子中还有1个羟基。在此基础上进一步经与文献[14]波谱数据比较基本一致,化合物8鉴定为6-羧基-1-甲氧羰基-2,8-二羟基呫吨-9-酮。

化合物9，10与实验室标准品对照核磁共振谱及硅胶薄层tR值基本一致，分别鉴定为麦角甾醇和过氧麦角甾醇。

采用文献[7]报道的二倍稀释法测试化合物1,2,3,4,5,6,7,8对小麦赤霉、香蕉炭疽的抗菌活性，以三唑酮为阳性对照(MIC150μg/mL)，结果有3个化合物活性良好，包括化合物6对两菌MIC为150μg/mL，化合物8对两菌MIC分别为200和150μg/mL，化合物2对香蕉炭疽MIC为200μg/mL，因此推断它们是菌株显示抗植物病原真菌活性的重要原因，有必要作为抗真菌先导物开展深入研究。其余活性测试结果均为MIC> 400μg/mL。

2 实验部分

2.1 试剂与实验仪器

AV600核磁共振波谱仪(BrukerBiospinAG)，MDSSCIEXAPCI2000液质联用仪，HoribaSEPA-300旋光仪。GF254薄层层析硅胶、200～300目柱层析硅胶(青岛海洋化工公司)，SephadexLH-20凝胶(GEHealthcare)，其他常规试剂均为分析纯。

2.2 菌种及细胞

真菌Alternariasp. R6采集自广东湛江红树林的植物苦槛蓝的根部，通过与文献Alternaria属进行形态特征对比得到鉴定[15]，植物病原菌小麦赤霉和香蕉炭疽菌引种自华南农业大学农学院，保藏于华南农业大学材料与能源学院(原理学院)。

2.3 菌种发酵培养

采用大米培养基(1 000 mL 三角烧瓶，每瓶含大米80 g，人工海水100 mL) 静置固相培养30 d，共培养70瓶。

2.4 分离

将培养物用甲醇浸泡3次，减压浓缩，水相再用乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，50 ℃下减压浓缩得到总浸膏53 g。提取物经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度淋洗分段，再经反复硅胶柱层析，Sephadex LH-20凝胶色谱和重结晶纯化后得到化合物1(5 mg)，2(6 mg)，3(5 mg)，4(4 mg)，5(3 mg)，6(4 mg)，7(3 mg)，8(6 mg)，9(60 mg)，10(20 mg)。

2.5 抗真菌活性测试

采用文献[7]报道的二倍稀释法测试化合物1,2,3,4,5,6,7,8对小麦赤霉、香蕉炭疽的抗菌活性，记录结果时间为28 ℃下小麦赤霉菌培养24 h，香蕉炭疽菌培养48 h，用三唑酮作为抗真菌的阳性对照，无菌生长的样品浓度即为最小抑菌浓度(MIC)值。

2.6 化合物的物理和波谱数据

化合物6: C16H14O5，黄色粉末，HRESI-MSm/z: 286.083 8[M]+(计算值为286.084 1);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ: 2.43 (3H,s),3.94(3H,s),4.93(2H,s), 6.62(1H,d,1.8 Hz),6.70(1H,d,1.8 Hz),6.80(1H,d,2.4 Hz),6.89(1H,,d,2.4 Hz),12.63(1H,s);13C NMR(150 MHz,,CDCl3)δ:183.0,164.9, 161.6,160.0,148.5,114.8,112.7,111.6,107.1,106.9,100.0,65.3,55.9, 55.6,22.5。

化合物7: C16H12O5，黄色针状晶体；HREIMSm/z: 284.067 3[M]+(计算值为284.067 9);1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 12.15 (1H,s),7.74 (1H,t,8.4,7.2 Hz),7.53 (1H,d,8.4,1.2 Hz),7.31 (1H,d,7.2,1.2 Hz),6.76 (1H,,d,1.2 Hz),6.64 (1H,d,1.2 Hz),4.03 (3H,s),2.44 (3H,s);13C NMR(150 MHz,,CDCl3)δ:180.5,169.6,161.5,156.1,155.7,149.4,134.7,133.7,122.6,119.5,117.6,111.5,107.4, 107.0,53.1,22.6。

化合物8: C16H10O8，黄色针状晶体，ESIMSm/z329 [M-H]-;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 12.21 (1H,s),10.71 (1H,s),7.67 (1H,d,9.0 Hz),7.53 (1H,d,9.0 Hz),7.48 (1H,d,1.2 Hz),7.20 (1H,d,1.2 Hz),3.86 (3H,s)；13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 180.6,166.6,165.8,160.5,155.3, 150.9,149.1, 140.6,125.8,120.2,117.3,116.9,109.9,109.8,107.7,52.2。

化合物9 和10的物理和波谱数据略。

[1] 林永成. 海洋微生物及其代谢产物[M]. 北京：化学工业出版社，2003.

[2] 洪葵．红树林放线菌及其天然产物研究进展[J]．微生物学报，2013，53(11):1131-1141.

[3] 宋双，薛艳钰，陆勇军，等. 南海红树林内生真菌Fusariumsolani387# 次级代谢产物研究[J]. 中山大学学报(自然科学版), 2015,54(5):67-71.

[4] NOWICKI M,NOWAKOWSKA M,NIEZGODA A, et al.Alternariablack spot of crucifers: symptoms,importance of disease,and perspectives of resistance breeding [J]. Vegetable Crops Research Bulletin,2012,76: 5-19.

[5] 丁唯嘉，张穗强，龚兵，等. 半红树植物苦槛蓝内生真菌的分离及抗植物病原菌活性研究 [J]. 广东农业科学，2014，41(3): 74-78.

[6] WANG J H,Cox D G,DING W J, et al,Three new resveratrol derivatives from the mangrove endophytic fungusAlternariasp. [J]. Marine Drugs,2014,12: 2840-2850.

[7] WANG J H,DING W J,WANG R M, et al. Identification and bioactivity of compounds from the mangrove endophytic fungusAlternariasp. [J]. Marine Drugs, 2015,13: 4492-4504.

[8] SHIONO Y,MURAYAMA T,TAKAHASHI K, et al. Three oxygenated cyclohexenone derivatives produced by an endophytic fungus [J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry, 2005,69(2): 287-292.

[9] VATCHARIN R,SATHIT B,SOUWALAK P,et al. Amide,cyclohexenone,and cyclohexenone- sordaricin derivatives from the endophytic fungus Xylaria plebeja PSU-G30 [J]. Tetrahedron, 2013, 69(50): 10711-10717.

[10] LEE M D,FANTINI A A,MORTON G O,et al. New antitumor antibiotic,LL-C10037α, fermentation,isolation and structure determination [J]. Journal of Antibiotics,1984,37(10): 1149-1152.

[11] SHEN B,WHITTLE Y G,GOULD S J,et al. Structure and absolute stereochemistry of the epoxy-quinol LL-C10037α and related metabolites from Streptomyces LL-C10037 [J]. Journal of Organic Chemistry,1990,55 (14): 4422-4426.

[12] PAN J H,DENG J J,CHEN Y G,et al. New lactone and xanthone derivatives produced by a mangrove endophytic fungusPhomasp. SK3RW1M from the South China Sea [J]. Helvetica Chimica Acta,2010,93 (7): 1369-1374.

[13] SHAO C L,WANG C Y,WEI M Y,et al. Structure elucidation of two new xanthone derivatives from the marine fungusPenicilliumsp. (ZZF 32#) from the South China Sea [J]. Magnetic Resonance Chemistry,2008,46(11):1066-1069.

[14] SUN Y L,ZHANG X Y,ZHENG Z H,et al. Three new polyketides from marine-derived fungusPenicilliumcitrinumSCSGAF 0167 [J]. Natural Product Research, 2014,28(4): 239-244.

[15] SHI J,ZENG Q,LIU Y,et al.Alternariasp. MG1,a resveratrol-producing fungus: isolation,identification,and optimal cultivation conditions for resveratrol production [J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2012,95(2): 369-379.

Study on the metabolites by solid fermentation from the mangrove endophytic fungusAlternariasp. R6

CHENMin1,ZHOUDanli2,ZHUJunjie2,FENGZihao2,QIUYuankun2,SHEZhigang3,LIChunyuan2

(1. Center of Experimental Teaching for Basic Courses, South China Agricultural University Guangzhou 510642,China;2. College of Materials and Energy,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;3. College of Chemistry and Chemical Engineering,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China)

To study the metabolites of the mangrove fungusAlternariasp. R6, the compounds were isolated by silica gel and Sephadex LH-20 column chromatography. Their structures were characterized by spectroscopy. The antifungal activities were investigated using the broth tube dilution method. Ten compounds, including (4R,5R)-4,5-dihydroxy-3-methoxy-5-methyl-cyclohex-2-en-1-one(1), (4R, 5S,6R)-4,5,6-trihydroxy-3-methoxy-5-methyl-cyclohex-2-en-1-one (2), xylariacyclone B (3), (4S, 5S,6S)-5,6-epoxy-4-hydroxy-3-methoxy-5-methyl-cyclohex-2-en-1-one (4), LL-C10037α(5), 1- hydroxy-8-(hydroxymethyl)-6-methoxy-3-methyl-9H-xanthen-9-one (6), 8-hydroxy-6- methyl- 1- meth-oxycarbonyl-xanthen-9-one (7), 8-dimethoxy-1,6-dimethoxycarbonyl-xanthen-9-one(8), ergosterol and ergosterolperoxide, were isolated from the methanol extracts. Among them, the compounds 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 8 were obtained fromAlternariasp. for the first time. The compounds 6 and 8 showed good inhibitory activity againstFusariumgraminearumSchw. andColletotrichummusae(Berk. & M. A. Curtis) Arx. While the compound 2 only showed good inhibitory activity against the latter.

mangrove endophytic fungi;Alternariasp.；xanthone; cyclohexenone; antifungal activity

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.03.020

2016-01-08

国家自然科学基金资助项目(21102049，41276146)；广东省自然科学基金资助项目(2015A030313405，9151027501000055)；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目([2015]311)；广州市科技计划资助项目(11C12100771)

陈敏(1967年生)，女;研究方向：化学生态学；通讯作者: 李春远，佘志刚;E-mail:chunyuan-li@163.com

O629.9

0529-6579(2016)03-0117-05