山楂叶总黄酮对肺缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

刘雪峰

(河北省邢台市第一医院，河北 邢台 054001)



山楂叶总黄酮对肺缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

刘雪峰

(河北省邢台市第一医院，河北 邢台 054001)

[摘要]目的研究山楂叶总黄酮(HLF)对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法将120只清洁级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、山楂叶总黄酮低剂量组(15 mg/kg)、山楂叶总黄酮中剂量组(30 mg/kg)、山楂叶总黄酮高剂量组(60 mg/kg)和舒血宁组。除假手术组外，其余组均采用无创动脉夹夹闭左肺门45 min然后去夹的方法制备肺缺血再灌注损伤大鼠模型，各给药组大鼠于术前30 min通过腹腔注射给予相应药物。再灌注2 h后，测定动脉血氧分压[p(O2)]，计算肺组织湿/干质量比(W/D)，HE染色观察肺组织病理形态学改变，TUNEL染色观察肺细胞凋亡情况；检测血清丙二醛(MDA)含量、髓过氧化物酶(MPO)活性及总抗氧化能力(T-AOC)水平，紫外可见分光光度计测定肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。结果山楂叶总黄酮高剂量组p(O2)和血清T-AOC水平均明显高于模型组(P均<0.05)，山楂叶总黄酮中、高剂量组大鼠血清MDA含量和MPO活性及肺组织W/D均显著低于模型组(P均<0.05)；山楂叶总黄酮各剂量组大鼠肺组织病理学改变和肺细胞凋亡状况均较模型组明显好转，以高剂量组效果最为显著；山楂叶总黄酮中、高剂量组大鼠肺组织中SOD、CAT活性显著高于模型组(P均<0.05)。结论山楂叶总黄酮对大鼠肺缺血再灌注损伤具有剂量依赖性的保护作用，其机制可能与山楂叶总黄酮能够有效提高机体自由基清除能力、抑制氧化应激损伤有关。

[关键词]山楂叶总黄酮；肺组织；缺血再灌注；保护作用

山楂叶是蔷薇科山楂属植物山里红叶或山楂叶，为我国传统中药。山楂叶总黄酮(hawthorn leaves flavonoids，HLF)是指从山楂叶中提取的黄酮类化合物的总称，其具有明显的抗氧化、调节血脂、抗脑缺血和心肌缺血等多种生物学活性[1-4]。本实验采用夹闭左肺门45 min后松夹的方法制备肺缺血再灌注损伤大鼠模型，研究山楂叶总黄酮对肺缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其作用机制。

1实验资料

1.1实验动物清洁级雄性SD大鼠120只，体质量240～280 g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2药物与试剂山楂叶总黄酮(长春三九生物制药，批号：20140518)；舒血宁注射液(神威药业有限公司，批号：201401027)；丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；TUNEL检测试剂盒购自美国密理博公司；水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3仪器DH-1型动物人工呼吸机(浙江大学医学仪器有限公司)；BS200 全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；UV-5500型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；石蜡切片机(德国SLEE公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；FS-2组织匀浆机(金坛市盛威实验仪器厂)；24D台式高速离心机(深圳市赛泰克生物科技有限公司)；300型血气分析仪(美国雅培公司)。

1.4实验方法将120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、山楂叶总黄酮低剂量组(15 mg/kg)、山楂叶总黄酮中剂量组(30 mg/kg)、山楂叶总黄酮高剂量组(60 mg/kg)和舒血宁组(4 mg/kg)，每组20只。除假手术组外，其余组大鼠均参照文献[5]试验方法复制肺缺血再灌注大鼠模型：经腹腔注射10%水合氯醛实施麻醉后，气管插管，连接动物呼吸机，于左胸第4—5肋间开胸，用无创血管夹闭左肺门，45 min后松夹恢复血流再灌注，整个过程辅助机械通气；假手术组行手术通路，除不夹闭左肺门外，其余操作同手术组。各给药组均于术前30 min腹腔注射给予相应药物干预，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水。

1.5观察项目

1.5.1动脉血氧分压[p(O2)]的检测再灌注2 h后，每组取10只腹腔注射10%水合氯醛实施麻醉，开腹经腹主动脉取血，经血气分析仪测定p(O2)。

1.5.2肺组织湿/干质量比(W/D)的测定1.5.1取血完成后，每组取6只大鼠开胸取左肺下叶，冲洗干净、滤纸吸干后称质量，为湿质量(W)；置60 ℃烘箱24 h后称质量，为干质量(D)，计算两者之比为肺 W/D。

1.5.3肺组织病理形态学观察将1.5.1取血完成后每组剩余4只开胸取大鼠相同部位左肺下叶组织，4%多聚甲醛固定，经石蜡包埋和切片(厚度为5 μm)，HE染色，然后通过光学显微镜观察各组大鼠肺组织病理形态改变。

1.5.4肺组织细胞凋亡状况观察按照1.5.3方法步骤制备肺组织石蜡切片，根据TUNEL染色试剂盒说明进行TUNEL染色，通过光学显微镜观察肺组织细胞凋亡状况。

1.5.5血清MDA含量、MPO活性及总抗氧化能力(T-AOC)水平的检测再灌注2 h后，取每组剩余10只大鼠腹腔注射10%水合氯醛实施麻醉，开腹经腹主动脉取血，2 000 r/min离心10 min后取血清，按照试剂盒操作步骤，通过紫外可见分光光度计测定MDA含量、MPO活性及T-AOC水平。

1.5.6肺组织匀浆中SOD、CAT活性检测将1.5.5取血后大鼠开胸取相同部位1.0 g左肺下叶组织，用冷生理盐水冲洗干净，剪碎后用组织匀浆器研磨匀浆，通过紫外可见分光光度计测定各组大鼠肺组织匀浆中SOD、CAT活性。

2结果

2.1各组大鼠p(O2)比较假手术组、模型组、山楂叶总黄酮低剂量组、山楂叶总黄酮中剂量组、山楂叶总黄酮高剂量组、舒血宁组p(O2)分别为(97.1±2.6)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、(85.9±3.4)mmHg、(87.2±3.2)mmHg、(90.8±3.6)mmHg、(93.4±4.0)mmHg、(88.6±3.9)mmHg。模型组p(O2)明显低于假手术组(P<0.05)，山楂叶总黄酮高剂量组显著高于模型组(P<0.05)。

2.2各组大鼠血清MDA含量、MPO活性以及T-AOC水平比较模型组大鼠血清MDA含量和MPO活性均明显高于假手术组(P均<0.05)，T-AOC水平明显低于假手术组(P均<0.05)；山楂叶总黄酮中、高剂量组MDA含量和MPO活性均明显低于模型组(P均<0.05)，舒血宁组MDA含量明显低于模型组(P均<0.05)，山楂叶总黄酮高剂量组T-AOC水平显著高于模型组(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血清MDA含量、MPO活性以及

注：①与假手术组比较，P<0.05;②与模型组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠肺组织W/D比较假手术组、模型组、山楂叶总黄酮低剂量组、山楂叶总黄酮中剂量组、山楂叶总黄酮高剂量组、舒血宁组肺组织W/D分别为4.9±0.3,6.5±0.5，6.1±0.6，5.7±0.4，5.5±0.4，5.8±0.6。模型组大鼠肺组织W/D明显高于假手术组(P<0.05)，山楂叶总黄酮中、高剂量组和舒血宁组均明显低于模型组(P均<0.05)。

2.4各组大鼠肺组织病理形态学表现HE染色光学显微镜下观察发现，假手术组大鼠肺组织未见异常，见图1；模型组大鼠肺泡结构紊乱，上皮细胞变性、坏死，肺泡内存在大量渗出液体，炎症细胞浸润，见图2；山楂叶总黄酮各剂量组和舒血宁组大鼠肺组织病理形态学较模型组改善，其中山楂叶总黄酮高剂量组改善最为显著，见图3～6。

图1　假手术组大鼠肺组织病理形态学改变(HE，×400)

图2　模型组大鼠肺组织病理形态学改变(HE，×400)

图3　山楂叶总黄酮低剂量组大鼠肺组织

图4　山楂叶总黄酮中剂量组大鼠肺组织

2.5各组大鼠肺细胞凋亡状况经过TUNEL染色，凋亡细胞呈胞核黄染。光学显微镜观察发现，假手术组大鼠肺组织存在极少量凋亡细胞，见图7；模型组大鼠肺组织凋亡状况较假手术组明显加重，见图8；山楂叶总黄酮各剂量组和舒血宁组大鼠肺组织凋亡状况明显减轻，以山楂叶总黄酮高剂量组改善最为显著，见图9～12。

图5　山楂叶总黄酮高剂量组大鼠肺组织

图6　舒血宁组大鼠肺组织病理形态学改变(HE，×400)

图7　假手术组大鼠肺细胞凋亡状况(TUNEL，×400)

图8　模型组大鼠肺细胞凋亡状况(TUNEL，×400)

2.6各组大鼠肺组织匀浆中SOD、CAT活性比较模型组大鼠肺组织匀浆中SOD、CAT活性明显低于假手术组(P均<0.05)；山楂叶总黄酮中、高剂量组大鼠肺组织匀浆中SOD、CAT活性明显高于模型组(P均<0.05)。见表2。

图9　山楂叶总黄酮15 mg/kg组大鼠肺细胞

图10　山楂叶总黄酮30 mg/kg组大鼠肺细胞

图11　山楂叶总黄酮60 mg/kg组大鼠肺细胞

图12　舒血宁4 mg/kg组大鼠肺细胞凋亡状况(TUNEL，×400)

3讨论

肺缺血再灌注损伤是临床上开展肺移植、体外循环心脏等手术时常发生的肺损伤现象，是导致术后肺功能障碍的重要原因。随着对其病理生理机制研究的不断深入，发现恢复血流再灌注后，随着氧的大量涌入而导致氧自由基的大量生成与过剩，进而引发的肺组织广泛氧化应激损伤和肺细胞凋亡是肺缺血再灌注损伤重要的病理生理基础。麻日虎等[6]和廖秀清等[7]通过动物实验研究发现，药物干预肺缺血再灌注损伤大鼠模型可改善抗氧化酶系统活性，抑制氧化应激损伤，抑制细胞凋亡，从而对肺缺血再灌注损伤起到保护作用。本实验采用夹闭左肺门45 min后去夹的方法制备肺缺血再灌注损伤大鼠模型进行研究，发现山楂叶总黄酮30，60 mg/kg预处理后能够有效降低肺缺血再灌注损伤大鼠W/D，其中60 mg/kg预处理还能有效提高p(O2)；山楂叶总黄酮预处理能够有效改善肺组织病理学改变并抑制肺组织细胞凋亡，以60 mg/kg预处理效果最为显著；提示山楂叶总黄酮对大鼠肺缺血再灌注损伤具有剂量依赖性的保护作用。

表2　各组大鼠肺组织匀浆中SOD、CAT活性

注：①与假手术组比较，P<0.05; ②与模型组比较，P<0.05。

血清中脂质过氧化终产物MDA含量能够间接反映机体氧化应激损伤程度；MPO是中性粒细胞特有的酶，其活性也能够间接反映氧化应激损伤程度[8]。SOD能够提供氢原子配体而催化还原氧自由基生成H2O2，并在CAT的作用下进一步还原生成对人体无害的H2O和O2[9]；血清中T-AOC水平能够反映机体整体抗氧化能力水平；因此SOD、CAT活性和T-AOC水平能够反映机体抗氧化能力。本实验结果发现，山楂叶总黄酮30，60 mg/kg预处理后肺组织匀浆中SOD、CAT活性显著升高，血清MDA含量及MPO活性显著降低，并且60 mg/kg预处理还能有效提高血清T-AOC水平；提示山楂叶总黄酮能够剂量依赖性地改善肺缺血再灌注大鼠抗氧化酶活性，抑制氧化应激损伤。

综上所述，山楂叶总黄酮对大鼠肺缺血再灌注损伤具有剂量依赖性的保护作用，其机制可能与山楂叶总黄酮能够有效改善肺组织抗氧化酶活性、进而抑制氧化应激损伤有关。

[参考文献]

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[2]杨宇杰,林静,王春民,等. 山楂叶总黄酮对大鼠高脂血症早期干预的实验研究[J]. 中草药,2008，39(12):1687-1690

[3]李红,张爽,纪影实,等. 山楂叶总黄酮不同给药途径对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国老年学杂志,2012，3(32):995-997

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[5]Xia ZY,Gao J,Ancharaz AK. Protective effect of ischemic post conditioning on lung ischemia-reperfusion injury in rats and the role of heme oxygenase-1[J]. Chin J Traum,2009，12(3):162-166

[6]麻日虎,李莹,王玉璇. 参附注射液后处理对肺缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国药物与临床,2013，13(4):437-439

[7]廖秀清,熊平,肖晓. 黄芪甲甙对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 广东医学,2009，30(12):1778-1780

[8]段若望,李明新,宋炯. 不同血液pH值对大鼠肺移植时缺血再灌注损伤的影响[J]. 中华麻醉学杂志,2010，30(6):685-687

Study on the protection and mechanism of Hawthorn leaves flavonoids against lung ischemia-reperfusion injury in rats

LIU Xuefeng

(First Hospital of Xingtai, Xingtai 054001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the protective effects and mechanism of Hawthorn leaves flavonoids (HLF) against lung ischemia-reperfusion injury in rats. Methods 120 male SD rats were randomly divided into sham operation group, model group, HLF 15 mg/kg group, HLF 30 mg/kg group, HLF 60 mg/kg group and Shuxuening group. Except the sham operation group, the other animals were prepared for lung ischemia-reperfusion injury model of rats by interrupting the hilum of left lung for 45 min and then reperfusion. The animals in all groups were given normal saline or corresponding drug by intraperitoneal injection before 30 min of operation. After reperfusion for 2h, the p(O2) was detected, the lung tissue wet/dry (W/D) ratio was calculated, the histopathological changes were observed by HE dyed and apoptosis of lung tissue were observed by TUNEL dyed; the content of MDA, the activity of MPO, the level of T-AOC in serum, and the activity of SOD, CAT in lung tissue were detected.Results The value of p(O2) and T-AOC level in HLF 60 mg/kg group were markedly higher than those in model group (all P<0.05), the content of MDA, the activity of MPO and the lung tissue W/D ratio in HLF 30 mg/kg group and HLF 60 mg/kg group were significantly lower than those in model group (all P<0.05). The histopathological changes and apoptosis of lung tissue in all HLF group were improved significantly than those in the model group (all P<0.05), and the HLF 60 mg/kg group was the best; the content of MDA and the activity of MPO in HLF 30 mg/kg group and HLF 60 mg/kg group were significantly higher than those in model group (all P<0.05). Conclusion HLF has dose-dependent protective effects against lung ischemia-reperfusion injury in rats, which perhaps relate to its effects of improving antioxidant ability and inhibiting the oxidative stress.

Key words:Hawthorn leaves flavonoids; lung tissue; ischemia-reperfusion; protective effect

[作者简介]刘雪峰，男，本科，主要从事药学管理及研究工作。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.03.010

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)03-0257-05

[收稿日期]2015-08-26