健脾养血祛风方对脾虚证慢性湿疹小鼠模型干预的实验研究

朱卉雯，田　静,李忻红，马贤德，冯常青，王　敏

(1. 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2. 辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032)



健脾养血祛风方对脾虚证慢性湿疹小鼠模型干预的实验研究

朱卉雯1,2，田静1,2,李忻红2，马贤德1，冯常青2，王敏2

(1. 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2. 辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032)

[摘要]目的探讨健脾养血祛风方对脾虚证慢性湿疹小鼠模型的作用机制。方法将50只健康雄性小鼠随机分为空白组、模型组、西药组、中药高剂量组及中药低剂量组。除空白组外，其余小鼠均制备脾虚证慢性湿疹模型。中药高、低剂量组给予相应剂量健脾养血祛风方干预，西药组给予盐酸左西替利嗪干预，空白组和模型组均给予等量生理盐水。灌胃14 d后观察各组小鼠皮肤组织病理变化情况、耳肿胀度(耳质量差)、耳厚度差、脾脏指数及胸腺指数。结果中药高、低剂量组以及西药组小鼠病变皮肤组织病理示表皮角化过度不明显，棘层肥厚明显减轻，真皮内炎性浸润显著减少，内皮细胞肿胀减轻。与空白组比较，其他各组小鼠耳厚度差及耳肿胀度均显著增加(P均<0.05)；各给药组小鼠耳厚度差及耳肿胀度均明显低于模型组(P均<0.05)，各给药组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。与空白组比较，其他各组小鼠脾脏指数及胸腺指数均显著升高(P均<0.05)；各给药组小鼠脾脏指数及胸腺指数均明显低于模型组(P均<0.05)，各给药组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论健脾养血祛风方能够显著减轻脾虚证慢性湿疹小鼠模型耳肿胀度，减少耳厚度差；下调脾虚证慢性湿疹小鼠模型增高的脾脏指数及胸腺指数；抑制病变组织炎性反应，改善慢性湿疹皮损的病理结构。该方对脾虚证慢性湿疹小鼠模型具有较好的抗炎、抗过敏作用。

[关键词]健脾养血祛风方；脾虚；慢性湿疹；胸腺指数；脾脏指数

慢性湿疹常由急性、亚急性湿疹反复发作不愈转变而来，也可一开始即呈现慢性炎症，表现为患部皮肤浸润肥厚，皮损上有结痂和脱屑，随后出现色素沉着和苔藓样变，皮肤增厚部位可出现皲裂而致疼痛，损害较局限，边界也较急性湿疹清楚。现代医学认为慢性湿疹与Ⅳ型超敏反应有关，即由 T 淋巴细胞介导的迟发型变态反应。中医学对本病的认识历史悠久，《素问·至真要大论》有言：“诸痛痒疮，皆属于心，诸湿肿满，皆属于脾。”这是对皮肤疮疡病因病机的最早概括，揭示了本病虽病在表，而与五脏病机相连，尤其与脾关系密切，对后来有关湿疹病因病机的探讨、发展起了指导作用。本研究观察了健脾养血祛风方对脾虚证慢性湿疹小鼠模型耳肿胀度(耳质量差)、耳厚度差、脾脏指数、胸腺指数及组织病理变化的影响，旨在探讨该方对脾虚证慢性湿疹小鼠模型的可能作用机制，为临床应用提供理论依据和实验基础。

1实验资料

1.1动物昆明种SPF级健康小鼠50只，雄性，6～8周龄，体质量18～22 g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(辽):2003-0016。分笼饲养，自然光照，自由饮水进食。实验设计及实施过程中严格遵循动物实验的3R原则[1]。

1.2试剂2，4-二硝基氯苯(DNCB)，军事医学院药材供应站，批号991223。丙酮，国药集团化学试剂(沈阳)公司，批号20110805。DNCB用丙酮配制成7%和0.1%浓度备用。

1.3仪器电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，WS2-261-79型电热恒温水浴箱(北京长安科学仪器厂)，550酶标仪(美国Bio-Rad公司)，石蜡包埋机(EG1150型，德国徕卡公司生产)，打孔器(YLS-Q4型，山东省医学科学院研制)，脱水机(LEICA300型，德国徕卡公司生产)，切片机(LEICA RM2235型，德国徕卡公司生产)，数码显微镜(OLYMPUS BX41型，日本OLYMPUS公司生产)。

1.4药物健脾养血祛风方药物组成：党参15 g、白术15 g、山药20 g、生地20 g、当归20 g、制首乌20 g、鸡血藤20 g、防风25 g、蒺藜10 g、白藓皮20 g、甘草15 g。中药饮片均购自辽宁中医药大学附属医院药局，以传统方法煎煮浓缩，制成煎剂。盐酸左西替利嗪片(商品名：迪皿，重庆华邦制药有限公司，国药准字h10040249，5 mg/片)，用蒸馏水溶解制成混悬液。

1.5实验方法采用随机数字表法将50只小鼠随机分为空白组、模型组、西药组、中药高剂量组和中药低剂量组，每组10只。除空白组外，其他小鼠均制作脾虚证慢性湿疹模型。先采用小剂量反复DNCB涂抹的方法建立慢性湿疹模型[2-4]：致敏前将小鼠腹部去毛，面积约2 cm×2 cm，第1天外涂以7% DNCB 25 μL致敏，第2天强化1次；第5天给小鼠背部剪毛，面积约2 cm×2 cm，第6天开始在鼠右耳双面及背部剪毛区分别涂抹0.1% DNCB 5 μL、15 μL激发，每隔3 d 1次，共4次。观察造模各组动物的行为状态，若出现皮肤明显增厚、粗糙、干燥、暗红斑及褐色结痂，有少量毛发生长，动物回头舔舐频繁，烦躁不安明显即为造模成功。于小鼠慢性湿疹模型造模第12天起采用番泻叶致脾虚的方法制作小鼠脾虚模型[5]：给予小鼠灌服100%番泻叶煎剂 0.5 mL/只，1次/d，连续7 d。观察造模各组动物的行为状态：①大便溏泄；②食少纳呆；③消瘦，体质量减轻；④毛色无光泽；⑤蜷缩聚堆；⑥神态萎靡，易疲劳。①②项为主症，③～⑥项为兼症，具备全部主症及2项兼症时即认为脾虚造模成功[6-7]。末次致敏激发24 h后，中药高、低剂量组分别给予含原生药量1.33 g/鼠和0.33 g/鼠的健脾养血祛风方煎液灌胃，西药组予盐酸左西替利嗪0.03 mg/鼠灌胃，给药剂量根据人与小鼠体表面积比例进行换算，所有药物均配制成0.4 mL溶液。空白组及模型组均给予等量生理盐水灌胃。均连续灌胃14 d，末次给药后24 h，称体质量后处死小鼠，取材送检。

1.6观察项目

1.6.1形态学观察取小鼠耳部皮肤组织用10%福尔马林溶液固定以做病理组织学检查，苏木精-伊红(HE)染色, 光镜下观察各组小鼠耳部病变组织炎症细胞浸润情况。

1.6.2指标检测处死小鼠后立即剪下小鼠左右耳廓备检。用6 mm打孔器取同部位的左右两耳片，用微测量卡尺测定小鼠耳中部厚度，计算左右耳厚度差；用电子天平称量耳片质量，以左右耳片质量之差计为肿胀程度。处死小鼠后取出完整脾脏和胸腺，去掉筋膜及脂肪组织，天平称量脾脏和胸腺质量，脾脏(胸腺)质量除以该鼠体质量得脾脏(胸腺)指数。

2结果

2.1一般情况空白组小鼠精神状态好，皮毛色泽鲜亮，反应灵敏，饮水饮食正常，便质软，体质量稳定，体温无明显波动；其他各组小鼠在造模后，背部皮肤逐渐干燥、粗糙、肥厚，并因摩擦等机械性刺激而出现血痂，皮损处毛发稀疏，出现时而烦躁、回头舔舐等慢性湿疹表现；同时还出现懒动、嗜卧、毛发无光泽、反应迟钝、饮食减少、腹泻、便质稀、体质量减轻、体温低等脾虚表现。各给药组小鼠相互摩擦及回头舔舐明显减少，粗糙、肥厚减轻，毛发增多。中药高、低剂量组小鼠除上述表现外，用药第2天起大便逐渐正常，饮食亦趋于正常，体质量逐渐增加，体温回至正常。

2.2耳部皮肤组织病理表现空白组表皮无角化过度、增厚及海绵形成，真皮层无炎细胞浸润，无血管扩张，见图1。模型组表皮角化过度，棘层肥厚，细胞间水肿不明显，无表皮内水疱，真皮血管周围炎性浸润明显，见图2。西药组表皮角化过度不明显，棘层肥厚明显减轻，真皮内炎性浸润显著减少，内皮细胞肿胀减轻，见图3。中药高剂量组与西药组结构变化基本相似，见图4。中药低剂量组表皮角化过度及棘层肥厚，真皮内炎性浸润减少，内皮细胞肿胀减轻，见图5。

图1　空白组小鼠耳部皮肤组织病理改变(HE，×400)

图2　模型组小鼠耳部皮肤组织病理改变(HE，×400)

图3　西药组小鼠耳部皮肤组织病理改变(HE，×400)

图4　中药高剂量组小鼠耳部皮肤组织病理改变(HE，×400)

2.3耳厚度差及肿胀程度与空白组比较，其他各组小鼠耳厚度差及耳肿胀度均显著增加(P均<0.05)；各给药组小鼠耳厚度差及耳肿胀度均明显低于模型组(P均<0.05)，各给药组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.4脾脏指数和胸腺指数与空白组比较，其他各组小鼠脾脏脂数及胸腺指数均显著升高(P均<0.05)；各给药组小鼠脾脏指数及胸腺指数均明显低于模型组(P均<0.05)，各给药组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

图5　中药低剂量组小鼠耳部皮肤组织病理改变(HE，×400)

组别n耳厚度差/mm肿胀程度/mg空白组100.006±0.0090.436±0.210模型组100.260±0.035①3.810±0.513①西药组100.068±0.027①②1.503±0.638①②中药高剂量组100.088±0.027①②1.511±0.520①②中药低剂量组100.126±0.025①②1.562±0.443①②

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

表2　各组小鼠胸腺指数及脾脏指数比较±s，mg/g)

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

3讨论

慢性湿疹所表现出的皮肤肥厚、干燥粗糙、脱屑、抓痕、瘙痒剧烈等，与中医的“脾虚”有着密切关系[8-9]。脾主运化，脾虚运化无权，水液不能正常输布，而余湿羁留不去，病情顽固不化；脾虚生化乏源，散精失调，可致血虚，日久化燥生风，肌肤失于濡润，最终形成了脾弱血虚风燥的证候。健脾养血祛风方正是在这一理论基础上形成的治疗脾虚慢性湿疹的中药方剂，方中党参、白术健脾益气除湿，共为君药；生地、当归养血活血润燥，共为臣药；制首乌、鸡血藤养血活血通络，防风、蒺藜、白藓皮祛风除湿止痒共为佐药；甘草补脾益气，调和诸药，为使药。诸药合用，共奏健脾除湿、养血润燥、祛风止痒之效。

慢性湿疹主要表现为皮肤的慢性炎症反应，目前被普遍认为与IV型超敏反应有关，其病理变化相似，特点是伴有组织损伤和炎症反应，因此临床表现有时不易区别。实验结果显示，除空白组外，其余各组均不同程度表现出表皮增厚，角化过度，炎细胞浸润，内皮细胞肿胀。模型组小鼠耳部病理结果证实，慢性湿疹模型复制成功，其病理变化基本符合慢性湿疹病理改变。而各给药组小鼠耳部病理变化较模型组均有不同程度的改善，并与耳肿胀度、脾脏指数及胸腺指数的改变相符合。

本实验通过观察药物干预后各组小鼠耳厚度差、耳肿胀度、脾脏指数及胸腺指数的改变，结果发现致敏后的各组小鼠耳厚度差及耳肿胀度均较空白组有明显变化；与模型组比较，各给药组小鼠耳肿胀度明显减轻，局部炎症反应明显减轻，各给药组间比较差异无统计学意义。说明慢性湿疹的发生与局部炎症密切相关，同时健脾养血祛风方对局部炎症反应有良好的抑制作用。

脾脏是最大的外周免疫器官，成熟B淋巴细胞聚集于此，与细胞免疫关系密切。胸腺是机体中枢免疫器官，是T淋巴细胞成熟发育的场所。人体的脾脏指数和胸腺指数与体质量成正比，是反映脾脏、胸腺免疫功能的重要指标[10]。脾脏指数和胸腺指数的变化直接反映了机体免疫功能状态。本研究发现，脾虚证慢性湿疹模型组小鼠胸腺指数及脾脏指数均明显高于空白组，各给药组胸腺指数和脾脏指数均明显低于模型组。同时发现随着各项指标的改变，慢性湿疹的皮损也在逐渐改善，小鼠脾虚的症状也逐渐改善，说明免疫功能的改变与慢性湿疹及脾虚都密切相关，而健脾养血祛风方可以很好地调节低下的免疫功能，从“扶正祛邪”的角度达到治疗脾虚慢性湿疹的目的。

综上所述，健脾养血祛风方有较好的抗炎作用，同时能够通过抑制胸腺及脾脏指数，从而调节低下的细胞免疫功能，进而达到健脾益气祛湿的功效，值得临床应用与推广。

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Study on intervention of Jianpi Yangxue Qufengfang on mice model of syndrome of spleen deficiency with chronic eczema

ZHU Huiwen1,2, TIAN Jing1,2, LI Xinhong1,2, MA Xiande1, FENG Changqing2, WANG Min2

(1. Liaoning University of TCM, Shenyang 110032, Liaoning, China; 2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM, Shenyang 110032, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to investigate the possible therapeutic mechanism of Jianpi Yangxue Qufengfang (JPYXQFF) on mice model of syndrome of spleen deficiency with chronic eczema. Methods Fifty healthy male mouse were randomly divided into blank group, model group, western medicine group, TCM high dose group and TCM low dose group. Except blank group, all groups were induced to models of syndrome of spleen deficiency with chronic eczema. The animals were intervened with corresponding dose of JPYXQFF in TCM high and low group, and with levocetirizine hydrochloride in western medicine group, with equal dose of physiological saline in blank and model group. The pathological changes of skin, ear swelling degree, ear thickness difference, spleen index, thymus index were observed after 14 days of intervention. Results TCM high and low dose group and western medicine group had obvious inhibitory effect on the local inflammation, and can improve the pathological of skin lesions. There was significant difference between the blank group and the others in ear swelling degree and ear thickness. (all P<0.05); the ear swelling degree and ear thickness difference in all treatment group were significantly thinner than that in the model group (all P<0.05), but there was no significant difference among the treatment groups (all P>0.05). The spleen index and thymus index were significantly increased in the other groups compared with the blank group (all P<0.05), and those indexes were decreased in the treatment groups compared with the model group (all P<0.05), but there was no significant difference among the treatment groups (all P>0.05). Conclusion JPYXQF can significantly reduce the ear swelling degree and ear thickness difference of mouse model of spleen deficiency syndrome with chronic eczema, and decrease the spleen index and thymus index, inhibit the inflammatory reaction of the tissue lesions, improve pathological structure of chronic eczema lesions. It has better anti-inflammatory and anti allergic effects on the mouse model of spleen deficiency syndrome of chronic eczema.

Key words:Jianpi Yangxue Qufengfang; syndrome of spleen deficiency; chronic eczema; spleen index; thymus index

[作者简介]朱卉雯，女，硕士，主治医师，研究方向为超敏反应性皮肤病的中医药治疗。[通信作者]田静，E-mail：18002413280@163.com

[基金项目]辽宁省中医药学(专)科能力建设项目(2011-lnzyxzk-03，辽宁省卫生厅)；辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(L2012342)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.03.003

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)03-0235-04

[收稿日期]2015-05-18