化痰通络方对急性脑梗死溶栓后内质网应激未折叠蛋白反应相关因子的影响

刘　爽　周　震　张玉莲　张琳琳　宋宛珊　王　凯　孙伟明

(天津中医药大学第二附属医院，天津　300150)



化痰通络方对急性脑梗死溶栓后内质网应激未折叠蛋白反应相关因子的影响

刘爽周震张玉莲张琳琳宋宛珊1王凯1孙伟明1

(天津中医药大学第二附属医院，天津300150)

〔摘要〕目的观察化痰通络方对急性脑梗死大鼠重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)溶栓后内质网应激(ERS)未折叠蛋白反应(UPR)相关分子基因和蛋白表达的影响，探讨化痰通络方调控急性脑梗死溶栓后内质网稳态的作用机制。方法将160只健康SD大鼠随机分为假手术组、模型组、rt-PA 组、rt-PA+化痰通络组，每组40只，采用自身栓子法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO)，rt-PA组与rt-PA+化痰通络组于血栓注入后3 h一次性予以rt-PA溶栓治疗，后者联合给予9 ml/kg化痰通络方浓缩剂灌胃治疗，每日2次，分别于造模后6 h，1 d，3 d，7 d 4个时点，应用Western印迹法及荧光定量PCR检测UPR相关信号转导途径中关键靶点IRE1、PERK、ATF6蛋白和基因及GRP78/BiP基因表达水平。结果同一组内，与6 h相比，各组IRE1基因和蛋白均以6 h时表达量最高(P<0.05)，各组PERK、ATF6基因和蛋白与BiP蛋白以1 d时表达量最高(P<0.05)；与假手术组相比，模型组在4个时相中各指标的表达量均较假手术组明显增加(P<0.05)；与模型组相比，rt-PA组、rt-PA+化痰通络组IRE1基因和蛋白、BiP基因表达量增高(P<0.05)，PERK、ATF6基因和蛋白表达量降低(P<0.05)；rt-PA+化痰通络组IRE1基因和蛋白、BiP蛋白表达量高于rt-PA组，且以6 h、1 d、3 d差异显著(P<0.05)；PERK基因和蛋白表达与rt-PA组无明显差异(P>0.05)；rt-PA+化痰通络组ATF6基因和蛋白表达量低于rt-PA组，且以3、7 d差异显著(P<0.05)。结论化痰通络方可能通过调控急性脑梗死溶栓后大鼠脑组织ERS中 UPR靶分子IREI、BiP的表达，进而起到防止缺血再灌注损伤的保护作用。

〔关键词〕化痰通络方；缺血再灌注；内质网应激；未折叠蛋白反应

早期溶栓是治疗急性脑梗死最有效的方法〔1，2〕，可以有效降低脑梗死死亡率与致残率〔3〕。然而，脑缺血再灌注继发性损伤严重限制了急性脑梗死溶栓治疗的推广应用。脑缺血再灌注损伤可导致内质网腔内未折叠或错误折叠蛋白堆积，即内质网应激(ERS)〔4〕。而作为对ERS的响应，细胞在进化过程中形成了一条高度自我保护的信号转导通路，称为未折叠蛋白反应(UPR)，包括诱导分子伴侣的产生和蛋白质翻译减少等〔5，6〕。UPR的作用具有双重性，即在ERS早期恢复内质网(ER)稳态、维持生存，以保护细胞；但是长时间过强的刺激则会启动细胞凋亡途径，即在晚期产生病理损害〔7〕。我们前期研究发现化痰通络方联合溶栓治疗可减轻神经细胞水肿，明显缩小大鼠脑梗死的面积和体积，减少脑组织含水量，改善急性脑梗死大鼠脑组织形态学的变化〔8～10〕，但对于急性脑梗死溶栓后缺血再灌注损伤大鼠大脑梗死部位脑组织UPR重要靶点的影响未予报道。本实验观察化痰通络方中药对缺血半暗带区ERS后UPR相关信号转导途径中关键靶点表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级健康SD大鼠160只，雌雄各半，体重200～250 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK(京)2014-0004。

1.2实验药物化痰通络方中药处方：天麻10 g，半夏10 g，胆南星5 g，丹参30 g，川芎10 g，地龙10 g，酒大黄5 g。以上药物400 g(5付)，加10倍水，煎煮3次，每次0.5 h，煎煮液浓缩至500 ml，生药浓度为0.8 g/ml。以上均由天津中医药大学第二附属医院制剂室制备，4℃保存备用。注射用重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA，批号005765201304，德国勃林格殷格翰公司)，血栓诱导剂(批号20081218，长春国奥药业有限公司)。

1.3主要实验仪器DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)、54型紫外分光光度仪(上海光谱仪器有限公司)、Linegene9620(BIOER)荧光定量PCR仪、Neofuge13R型高速冷冻离心机(HealForce上海力申科学仪器有限公司)、TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)、WD-9405B型水平摇床(北京市六一仪器厂)、AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、DW-86L628型超低温保存箱(Haier)。

1.4模型制备取大鼠股动脉血3 ml制备3.5～5 mm的自体血栓条5～8块备用。参照张新江等〔11〕方法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型大鼠。模型组、rt-PA组和rt-PA+化痰通络组大鼠均以上述方法造模。假手术组手术注射时以生理盐水0.3 ml代替栓子溶液，余过程相同。

1.5动物分组与处理方法按随机数字表随机分为假手术组、模型组、rt-PA组和rt-PA+化痰通络组。每组40只，各组再分为6 h、1 d、3 d、7 d 4个时相〔12〕，每个时相各取10只大鼠进行相关检测。其中rt-PA组、rt-PA+化痰通络组在造模成功后予以rt-PA 5.67 mg/kg〔13〕加入0.9% 生理盐水2 ml中，一次性于20 min内由尾静脉缓慢注入以溶栓治疗；rt-PA+化痰通络组大鼠在此基础上每日需予9 ml/kg浓煎剂〔13〕，每日分2次灌胃，每次约0.9～1.4 ml药液(200～250 g大鼠)，其中6 h取材组于造模成功后给予中药1次，均采用灌胃方法给药。假手术组及模型组于相同时间点采用与rt-PA相等剂量生理盐水于溶栓由尾静脉缓慢注入，并且于灌服中药相同时间点，用与中药相等剂量的蒸馏水进行灌胃。

1.6观察指标与检测方法

1.6.1Western印迹法检测UPR相关信号转导途径中关键靶点IRE1、PERK、ATF6和葡萄糖调节蛋白78/免疫球蛋白结合蛋白(GRP78/BiP)蛋白水平各组大鼠在相应时间点断头取脑，并选取梗死部位脑组织匀浆。按照核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒说明抽提组织的总蛋白质，并进行蛋白质定量、电泳、转膜、封闭；加一抗(使用TBS稀释，浓度为1∶200～1∶1 000)，摇床上孵育2 h，TBST洗膜；加二抗(使用TBS 稀释，浓度为1∶2 000)，摇床上孵育2 h后，TBST洗膜。化学发光检测显影、定影、洗片，得到图像结果后应用专业软件测量灰密度值。

1.6.2荧光定量PCR检测UPR相关信号转导途径中关键靶点IRE1、PERK、ATF6基因水平各组大鼠在相应时间点断头取脑，并选取梗死部位脑组织匀浆。按照Trizol试剂盒(Gibco公司)说明提取总RNA，测定总RNA浓度。紫外分光光度计测量吸光度(A)值，A260/A280>1.8，将在0.1 g琼脂糖凝胶电泳上显示，证实含有18 s和28 s两条带的标本用于反转录步骤。按照逆转录试剂盒说明书，逆转录合成cDNA。采用25 μl反应体系：分别加入MasterMix 12.5 μl、5 μmol/L正义、反义引物各0.25 μl、Template 2.5 μl和Deionized水9.5 μl混匀(正义引物与反义引物分别为IRE1、PERK、ATF6引物序列)。放入荧光定量PCR仪中，条件为95℃、10 min后执行95℃，15 s，60℃，1 min，40个循环，以观察荧光定量熔解度。

1.7统计学方法采用SPSS11.5软件进行方差分析及t检验。

2结果

2.1各组大鼠脑梗死部位脑组织IRE1蛋白和基因表达的比较同一组内，与6 h相比，模型组7 d时、rt-PA+化痰通络组1 d和7 d时IRE1蛋白的相对丰度值明显降低(P<0.05)，且各组均以6 h相对丰度值最高，符合脑梗死发展规律。同一时相内，与假手术组相比，模型组在4个时相IRE1蛋白相对丰度值均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，rt-PA组6 h、rt-PA+化痰通络组6 h、7 d时IRE1蛋白的相对丰度值均明显增高(P<0.05)；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组在6 h IRE1蛋白的相对丰度值明显增加(P<0.05)，见表1，图1。同一组内，与6 h相比，rt-PA+化痰通络组1 d和3 d时IRE1 mRNA表达量均明显降低(P<0.05)，且均以6 h时为最高，符合脑梗死发展规律。同一时相内，与假手术组相比，模型组在6 h、1 d和3 d时IRE1 mRNA表达量均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，rt-PA组3 d时和rt-PA+化痰通络组6 h、1 d和3 d的IRE1 mRNA表达量均明显增加(P<0.05)；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组在6 h、1 d和3 d时IRE1 mRNA表达量均明显增加(P<0.05)，见表2。

表1　不同时相大脑梗死组织IRE1蛋白的

同一组内，与6 h相比：1)P<0.05；同一时相内，与假手术组相比：2)P<0.05；与模型组相比：3)P<0.05；与rt-PA组相比：4)P<0.05；表2同

图1　不同时相大脑梗死组织IRE1蛋白的相对丰度值

表2　不同时相大脑梗死组织IRE1 mRNA

2.2各组大鼠脑梗死部位脑组织PERK蛋白和基因表达的比较同一组内，与6 h相比，各时相PERK蛋白的相对丰度值均无明显差异(P>0.05)，但均以1 d时相对丰度值最高，符合脑梗死发展规律；同一时相内，与假手术组相比，模型组在4个时相中PERK蛋白的相对丰度值明显增加(P<0.05)；与模型组相比，仅有rt-PA+化痰通络组1 d时PERK蛋白的相对丰度值均明显降低(P<0.05)；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组在各时相PERK蛋白的相对丰度值均无明显差异(P>0.05)，见表3，图2。同一组内，与6 h相比，模型组、rt-PA组和rt-PA+化痰通络组1 d时的PERK mRNA表达量均有明显差异(P<0.05)，且均以1 d时为最高，符合脑梗死发展规律；同一时相内，与假手术组相比，模型组在各时相中PERK mRNA表达量均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，rt-PA组和rt-PA+化痰通络组除7 d之外，各时相的PERK mRNA表达量均明显降低(P<0.05)；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组在4时相PERK mRNA表达量均无明显差异(P>0.05)，见表4。

2.3各组大鼠脑梗死部位脑组织ATF6蛋白与基因表达的比较同一组内，与6 h相比，各组ATF6蛋白的相对丰度值均无明显差异(P>0.05)，但均以1 d时相对丰度值最高，符合脑梗死发展规律；同一时相内，与假手术组相比，模型组在4个时相中ATF6蛋白的相对丰度值均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，rt-PA组3 d、rt-PA+化痰通络组1、3、7 d时ATF6蛋白的相对丰度值均明显降低(P<0.05)；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组在7 d时ATF6蛋白的相对丰度值有明显降低(P<0.05)，见表5，图3。同一组内，与6 h相比，模型组、rt-PA组和rt-PA+化痰通络组1 d时的ATF6 mRNA表达量均明显增加(P<0.05)，且均以1 d时为最高，符合脑梗死发展规律；同一时相内，与假手术组相比，模型组在各时相中ATF6 mRNA表达量均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，rt-PA组1 d、3 d和rt-PA+化痰通络组各时相的ATF6 mRNA表达量均明显降低(P<0.05)；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组在3 d和7 d时相ATF6 mRNA表达量均有明显降低(P<0.05)，见表6。

表3　不同时相大脑梗死组织PERK蛋白的

与假手术组相比：1)P<0.05；与模型组相比：2)P<0.05

图2　不同时相大脑梗死组织PERK蛋白的相对丰度值

表4　不同时相大脑梗死组织PERK mRNA

同一组内，与6 h相比：1)P<0.05；同一时相内，与假手术组相比：2)P<0.05；与模型组相比：3)P<0.05

表5　不同时相大脑梗死组织ATF6蛋白的

同一时相内，与假手术组相比：1)P<0.05；与模型组相比：2)P<0.05；与rt-PA组相比：3)P<0.05

图3　不同时相大脑梗死组织ATF6蛋白的相对丰度值

组别6h1d3d7d假手术组0.78±0.082)0.89±0.150.70±0.090.61±0.09模型组1.53±0.052.60±0.201)2)1.58±0.172)1.46±0.102)rt-PA组1.43±0.041.69±0.131)3)1.42±0.173)1.41±0.10rt-PA+化痰通络组1.22±0.173)1.61±0.161)3)1.21±0.023)4)1.00±0.143)4)

同一组内与6 h相比：1)P<0.05；同一时相内，与假手术组相比：2)P<0.05；与模型组相比：3)P<0.05；与rt-PA组相比：4)P<0.05

2.4各组大鼠脑梗死部位脑组织BiP蛋白表达的比较同一组内，与6 h相比，各组BiP蛋白的相对丰度值均无明显差异，但均以1 d时相对丰度值最高，符合脑梗死发展规律；同一时相内，与假手术组相比，模型组在4个时相中BiP蛋白的相对丰度值均明显增加(P<0.05)；与模型组相比，rt-PA组除7 d外的各时相和rt-PA+化痰通络组各时相BiP蛋白的相对丰度值均明显增加(P<0.05)；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组各时相BiP蛋白的相对丰度值无明显差异(P>0.05)，见表7，图4。

表7　不同时相大脑梗死组织BiP蛋白的

同一时相内，与假手术组相比：1)P<0.05；与模型组相比：2)P<0.05

图4　不同时相大脑梗死组织BiP蛋白的相对丰度值

3讨论

急性脑梗死溶栓后缺血再灌注损伤，限制溶栓疗法广泛开展最直接、最主要的原因之一。目前尚无有效干预手段，而其机制与ERS密切相关。UPR，是细胞进化过程中在ERS早期形成了高度保守的自我保护的信号转导通路，也是ERS早期所活化的主要信号转导通路〔14〕。UPR的激活主要通过3个不同的内质网跨膜蛋白进行调节：肌醇需要酶1(IRE1)、双链RNA活化蛋白激酶样内质网激酶(PERK)和转录活化因子(ATF6)。无应激状态下，这3种跨膜蛋白分别与GRP78/BiP结合而处于失活状态。但当脑缺血再灌注等情况下，引起ERS，错误折叠蛋白在内质网腔内的蓄积可导致GRP78/BiP从三种跨膜蛋白上解离并激活，作为ERS早期的标志物大量表达，促进内质网中未折叠蛋白正确折叠、修饰，恢复蛋白质的正确构象，达到维持内质网稳态的作用〔14〕。而各跨膜蛋白在感应应激后，分别将信号传递给下游信号通路。

IRE1通路的中间产物与内质网应激反应元件(ERSE)和未折叠蛋白反应元件(UPRE)结合，通路能促进UPR靶分子(如GRP78/BiP和GRP94)的基因转录，上调GRP78/BiP和GRP94等的表达，进而促进内质网功能恢复〔15〕。PERK通路能特异磷酸化真核细胞蛋白翻译启动因子eIF2α，快速阻止了新生蛋白向内质网腔的转运，减轻了内质网的蛋白折叠压力〔16〕。ATF6是未折叠蛋白的感受器，应激时ATF6被切割成50 kD N端片段，并转移到细胞核内，作为转录因子促进含ERSE的转录因子XBP1和UPR靶分子BiP等基因转录〔17〕。

本实验研究考虑化痰通络法中药联合rt-PA溶栓治疗可能最先影响IRE1的表达量，进而影响其他指标发生变化〔18，19〕。rt-PA溶栓联合化痰通络方中药治疗急性脑梗死，可能通过增加梗死区域UPR靶分子IRE1基因和蛋白、BiP基因的表达，发挥内质网自稳功能，恢复内质网稳态，使细胞适应应激而存活，达到改善疾病预后的作用。

脑梗死属祖国医学“中风病”范畴，风痰瘀阻证在缺血性中风急性期起病中占绝对多数。根据中医学“急则治其标”的治疗原则，早期投以化痰泻浊、祛瘀通络方药切中病机。我们在临床工作中对于急性脑梗死风痰瘀阻证患者，采用化痰通络法联合溶栓治疗取得了满意疗效〔20，21〕。

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〔2015-10-07修回〕

(编辑李相军)

Effects of Huatan Tongluo on related factors of unfolded protein response in ERS after thrombolytic therapy in acute cerebral infarction

LIU Shuang, ZHOU Zhen, ZHANG Yu-Lian,et al.

The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150, China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of Huatan Tongluo therapy on related factors of unfolded protein response in ERS after thrombolytic therapy in acute cerebral infarction and investigate the mechanism of Huatan Tongluo for endoplasmic reticulum homeostasis after acute cerebral infarction after thrombolysis therapy.Methods160 healthy SD rats were randomly divided into 4 groups, sham operation, model, rt-PA and rt-PA combined with Huatan Tongluo groups, 40 rats in each group. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) rat model was prepared by autologous blood clots. Rats in rt-PA group and rt-PA combined with Huatan Tongluo groups were treated with rt-PA thrombolytic therapy after thrombosis, rats in rt-PA combined with Huatan Tongluo group were also given 9 ml/kg Huatan Tongluo prescription by gavage, two times a day. The expressions of IRE-1, PERK, ATF6 and GRP78/Bip in rat cortex and hippocampus were detected by Western blot and RT-PCR at 6 h,1 d,3 d and 7 d respectively.ResultsIRE1 gene and protein were the highest expression level in 6 h (P<0.05), PERK, ATF6 gene and protein and Bip protein expression were the highest in 1 d in the same group (P<0.05). At the same time point, compared with the sham operation group, the expressions of above indexes in the model group were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, expressions of IRE1 gene and protein, BiP gene were increased (P<0.05), the expressions of PERK, ATF6 gene and protein were decreased in rt-PA and rt-PA+ Huatan Tongluo groups(P<0.05). Compared with rt-PA group, expressions of IRE1 gene and protein, Bip protein were higher, and there were significant differences at 6 h, 1 d, 3 d in rt-PA+ Huatan Tongluo group (P<0.05). There were no significant differences in PERK gene and protein between rt-PA and rt-PA+ Huatan Tongluo groups (P>0.05). Compared with rt-PA group, the expressions of ATF6 gene and protein were lower in rt-PA+ Huatan Tongluo group and there were significant differences at 3 d, 7 d (P<0.05).ConclusionsHuatan Tongluo has protective effects on ischemia reperfusion injury induced by acute cerebral infarction after thrombolysis, which may relate to the regulation of the expression of, the related factors unfolded protein response in ERS such as IRE1 gene and protein, BiP gene and so on.

【Key words】Huatan Tongluo; Ischemia-reperfusion; ERS; Unfolded protein response (UPR)

基金项目：国家自然科学基金项目(81273942)；天津市应用基础及前沿技术研究计划(12JCZDJC25300)

通讯作者：周震(1974-)，男，医学博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事中西医结合神经内科临床与科研工作。

〔中图分类号〕R25

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2052-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.002

1天津中医药大学

第一作者：刘爽(1984-)，女，医学硕士，主治医师，主要从事中西医结合治疗脑病临床、科研及教学工作。