蓝耳病病毒（PRRSV）实验室诊断所面临的挑战

黎先伟 译



蓝耳病病毒（PRRSV）实验室诊断所面临的挑战

By Katarzyna Podgórska

黎先伟 译

自从1996年暴发以来，猪繁殖与呼吸综合症病毒（猪蓝耳病病毒，PRRSv）感染的临床表现越来越复杂多样，而且现在的感染主要以多种病原混合感染为主，这使得我们难以通过剖检和肉眼病变做出准确的判断，因此，对于猪蓝耳病病毒（PRRSv）的诊断必须通过实验室的分子生物学等检测手段来进行核实。随着技术的发展，猪蓝耳病病毒（PRRSv）的实验室诊断技术有了更多的选择，不过目前最常用于猪蓝耳病病毒（PRRSv）抗体和抗原的实验室检测分别是酶联免疫吸附试验（ELISA）和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。

如何选择一个合适的诊断方法，取决于诊断的目标。其中特异性高的诊断方法适用于监测猪蓝耳病病毒（PRRSv）阴性群体，而对公猪精液的检测则需要在感染的早期阶段采用敏感性极高的诊断方法。在制定和执行猪蓝耳病（PRRS）的防控计划中，最好是采用ELISA 和RT-PCR相结合的方法，并进行DNA序列的分析，以全面的监控猪场猪蓝耳病病毒（PRRSv）的动态变化。每个养猪场都必须根据猪蓝耳病病毒（PRRSv）的诊断目标、猪场的规模和养殖模式来单独地制定采样计划。简单的来说，我们判断一个猪场是否感染猪蓝耳病病毒（PRRSv），一般可通过ELISA的方法检测10至20份育肥猪的血清来回答。要想详细分析一点饲养或多点饲养生产系统中猪蓝耳病病毒（PRRSv）的循环（感染）状态，那么则需要采集大量的具有代表性的不同日龄（包括保育猪、生长猪和育肥猪）的猪群，以及一个生长系统中所有不同位置的样品，因为它们可能代表着一个独立的病毒生态系统。

要想解释血清转换或在一个使用猪蓝耳病活疫苗的养猪场中进行病毒的检测具有一定的难度，这主要是因为（1）目前市场上没有标记疫苗；（2）疫苗毒会在使用活疫苗的养猪场内长期存在；（3）至少在一段时间内疫苗毒与野毒会在猪场内共存。在这样的养猪场中，对不同日龄的猪群检测所获的核酸进行DNA序列分析，以便更充分的认识猪场内猪蓝耳病病毒（PRRSv）的循环（感染）状态。

基于酶联免疫吸附法（ELISA）的血清学诊断方法操作起来十分简便，而且具有较好的特异性和敏感性，适用于一个群体的基础检测。不过，个别的血清样品，尤其是育肥猪有可能会出现假阳性的情况。这对于猪蓝耳病病毒（PRRSv）阴性群体的监测来说可能会造成一定的困扰，因此，对于这种情况需要采用不同的检测方法来重新检测样品（包括免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA）或另一些特异性更高的ELISA试验）；或者2至3周后重新采集猪群样品进行检测。ELISA性能的这一方面很少解决诊断能力的评价。如果一个ELISA检测试剂盒的敏感性较低的话一般可通过增加检测样品数来克服；不过其特异性较低的话则往往需要额外的工具来协助做出正确的诊断。

一般来说，任何一个ELISA检测试剂盒通常只用于针对一种猪蓝耳病病毒（PRRSv）基因型的抗体进行检测，而这种只针对一种猪蓝耳病病毒（PRRSv）基因型的抗原所研发的ELISA试剂盒通常对另一种基因型的猪蓝耳病病毒（PRRSv）的敏感性较低。众所周知，猪蓝耳病病毒（PRRSv）主要分成两种基本的基因型，即欧洲型和美洲型。目前，美洲型猪蓝耳病病毒（PRRSv）是造成全球暴发高致病性猪蓝耳病的主要基因型，美洲型的毒力要比欧洲型的更强。不过，随着猪蓝耳病病毒（PRRSv）的变异，欧洲型猪蓝耳病病毒（PRRSv）在欧洲一些国家的发病率有所上升，而且造成较严重的临床症状。陆续有报道在我国分离到欧洲型猪蓝耳病病毒（PRRSv），这需要引起我们高度的重视。此外，目前也有试剂盒能够对两种基因型病毒的血清转化进行区分，不过需要注意的是，由于两者之间只有很少的血清交叉反应，因此用这种方法所获的的结果需谨慎对待。从目前来说，人们普遍推荐采用辨别式PCR来对养猪场内两种不同基因型猪蓝耳病病毒（PRRSv）的混合感染进行诊断。

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测病毒核酸的原理是，针对猪蓝耳病病毒（PRRSv）的一个特定的基因组片段设计一段可互补性结合的寡核苷酸（引物），并在特定条件下通过酶促反应将微量的待测病毒成倍放大。目前，实验室最为常用的检测方法是实时定量PCR，其是通过监测与特定序列结合的DNA探针所发出的信号，判断待检病毒的扩增情况。考虑到这种反应的特性，这样的信号也可能出现在缺失的病毒序列中，特别在聚合酶链反应的后期常有发生，这可能导致类似于弱阳性的结果。

然而，有关RT-PCR检测方法所主要关注的问题是病毒较高的遗传多样性，这可能会导致核苷酸序列突变的累积（包括引物序列或探针结合部位），从而出现假阴性的情况。OIE参考实验室对市场上的RT-PCR试剂盒进行比较分析（Podgorska et al.， 2015），结果表明一些商业化的RT-PCR试剂盒不能检测出大多数基因1型的猪蓝耳病病毒（PRRSv），这些病毒主要起源于东欧。由于源自东欧的基因1型猪蓝耳病病毒（PRRSv）的有效序列十分有限，因此，目前这种方法使用的大多数引物和探针都是以基因2型和基因1型1亚型的经典株为基础，而2-4亚型的东欧毒株从遗传角度来看具有较大的差异（Stadejek et al. 2013）。而且，相关研究已证实，其中一些东欧的猪蓝耳病病毒（PRRSv）要比目前在西欧和中欧流行的毒株毒力更强，因此我们应该对这种毒株给予更多的关注，以确保能够早期检测出它们向外蔓延的情况。

到目前为止，没有任何一种RT-PCR的检测方法可推荐作为一种通用的检测方法，以用于检测所有的猪蓝耳病病毒（PRRSv）且具有最佳的灵敏度。总的来说，上述的内容强调了，对于目前猪蓝耳病病毒（PRRSv）的流行毒株来说，全面评估目前使用的检测方法及其不断重新验证的必要性。对此，猪蓝耳病（PRRS）参考实验室已开始尽可能多的收集具有代表性的猪蓝耳病病毒（PRRSv），以覆盖病毒的遗传多样性，这是这些参考实验室目前最重要的工作之一，从而更全面的监测和了解猪蓝耳病病毒（PRRSv）的流行动态和变异情况。

备注：

1）抗体的检测

ELISA：

结果呈阳性：（1）感染猪蓝耳病病毒（疫苗毒或野毒）；（2）母源抗体（持续3至5周），未感染猪蓝耳病病毒；（3）非特异性抗体与检测板上的抗原相结合，为感染猪蓝耳病病毒；（4）外源性的猪蓝耳病病毒抗体（仅唾液）。

结果呈阴性：（1）未感染猪蓝耳病病毒；（2）刚感染猪蓝耳病病毒，但抗体尚未产生（小于9天）；（3）抗体的含量很低未能检测出；（4）感染期结束，呈血清反应阴性；（5）持续感染猪群，但呈血清反应阴性；（6）对非常特异的病毒株所产生的抗体检测失败。

2）抗原的检测

PCR：

结果呈阳性：（1）感染猪蓝耳病病毒（疫苗毒或野毒）；（2）存在非传染性病毒感染；（3）样品污染，猪群未感染病毒。

结果呈阴性：（1）不存在病毒RNA；（2）病毒的含量很低未能检测出；（3）样品降解不能检出病毒；（4）引物或探针不匹配不能检出病毒；（5）样品中检测不到病毒RNA，但猪群持续感染病毒；（6）样品中检测不到病毒RNA，但猪群呈隐形带毒感染。