动物皮肤致敏试验方法的研究进展*

喻才正，　周　婷，　黄　倩，　周　爽

武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉　430065



综述

动物皮肤致敏试验方法的研究进展*

喻才正，周婷△，黄倩，周爽

武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉430065

关键词：变态反应性接触性皮炎；替代试验；接触性致敏物

人们在日常生活或工作中皮肤经常会接触各种外源性化合物(化妆品、染发剂、橡胶制品等)，长期反复接触这类化学物质很可能会导致皮肤发生过敏反应，出现瘙痒、红斑、丘疹、水肿甚至溃疡等临床特征的变态反应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)。ACD是个体皮肤或黏膜接触变应原后，变应原与表皮细胞蛋白结合形成具有致敏性的复合物，刺激机体免疫系统产生以T细胞介导的皮肤迟发型变态反应性组织损伤的疾病。据统计，西方国家15%～20%的人群(全世界约有1%人口)至少会对一种过敏原(如金属类物质、染色剂、防腐剂以及化妆品和橡胶中的某些有机化合物)产生过敏反应，变态反应性接触性皮炎已成为一种主要的职业性皮肤病[1-4]。目前，ACD的发病机制尚不十分明确，临床上也无完全治愈的方法，通常使用皮质类固醇对症治疗。因此，为了降低ACD的发病率，采用简便、快速、准确的检测方法分析化学物的皮肤致敏性，早期采取有效的防护措施，对保护人群健康具有重要的指导作用。一般通过试验动物反复接触受试物后出现的过敏反应预测人群接触该物质后是否出现过敏反应及出现过敏反应的程度，因此，本文就动物皮肤致敏试验方法的研究进展作一综述。

动物的皮肤致敏试验可分为整体动物试验、体内替代试验、体外替代试验。随着科学技术的发展以及大量新型化学物品的上市，生产者和消费者将会接触到更多具有潜在致敏性的化学物品。近年来，随着动物福利原则和“3R”即减少(reduction)、替代(replacement)、优化(refinement)原则的推进，体外评价化学物潜在致敏性的方法也逐渐受到人们的广泛关注[5-8]。

1整体动物试验

检测化学物皮肤致敏性的整体动物试验方法包括豚鼠最大值试验(guinea pig maximization test，GPMT)和局部封闭涂皮试验(buehler test，BT)。GPMT使用弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)作为免疫增强剂，试验包括皮内注射、局部接触诱导和激发封闭斑贴3个过程。而BT法不使用佐剂，只需在诱导期和激发期对局部皮肤涂抹受试物。根据变态反应试验皮肤反应评分准则对豚鼠进行评分，从而确定出现阳性反应的豚鼠数量并计算致敏度(阳性反应豚鼠数占各组豚鼠总数百分比)，当致敏度≤28%时判断为非致敏物，反之为致敏物。由于BT法没有使用弗氏完全佐剂免疫增强剂来刺激免疫系统，该方法的灵敏度比GPMT低[9]。GPMT法筛选弱致敏原的能力较强，但佐剂的使用可能会过高地估计受试物的致敏潜力；而BT法能够较准确地检测出中度至重度的致敏物。

整体动物试验的最大优点是对致敏物的敏感性强，但需要的动物数量较多、试验周期长，如果试验结果难以确定，还需增加动物只数，且试验结果是通过观察豚鼠皮肤出现红斑和水肿的反应及其程度对其进行评分，易受观察个体主观因素的影响。此外，该类方法无法鉴定一些能使动物皮肤染色的化学品(如染料、色素)的致敏性。

2体内替代试验

体内替代试验是用小鼠代替豚鼠的试验方法，包括鼠耳廓肿胀试验(mouse ear swelling test，MEST)、非侵入性鼠耳廓肿胀分析法(noninvasive mouse ear swelling assay，MESA)和局部淋巴结试验(local lymph node assay，LLNA)。与整体动物试验相比，体内替代试验明显减少了试验动物数量；并以体积小的动物代替体积大的动物，减少了实验室的使用面积和耗能，改进了试验结果的测量方法，使结果更客观，实现了减少和优化原则。目前，美国食品和药品管理局以及经济合作与发展组织(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD)将LLNA方法收录在新的致敏试验指南中[10-11]。

2.1鼠耳廓肿胀试验(MEST)和非侵入性鼠耳廓肿胀分析法(MESA)

MEST方法是预先向小鼠腹部皮内注射弗氏完全佐剂，再用胶带剥脱法多次剥离腹部皮肤角质层后涂受试物，然后连续3 d将受试物敷于脱毛部位中央，7 d后将受试物涂于一侧耳廓，测量涂药前后24、48 h小鼠耳廓厚度的变化，鼠耳廓肿胀厚度超过20%者判为致敏物[12]。该方法具有耗资低、试验周期短、评分客观、排除受试物颜色的干扰等优点，可定量分析化学物质引起的迟发性接触超敏反应的程度，现已广泛应用于光毒反应、光敏反应的研究中。但该方法灵敏度较低，一般只适合作为筛选，阴性结果的化学物仍需其它试验方法加以确认。

MESA与MEST的基本方法相似，也是通过测量小鼠耳部的肿胀程度评估受试物致敏潜能。但MESA法不需要进行小鼠腹部皮下注射弗氏完全佐剂、破坏腹部皮肤的角质层屏障等步骤，减少了侵入性操作。若给予小鼠高维生素A饮食时，MESA法的小鼠致敏反应强度可放大数倍，可用于检测极低浓度的已知致敏物导致接触性致敏性皮炎的潜能，其灵敏度高于人体试验，与豚鼠试验相当[13-14]。

2.2小鼠局部淋巴结试验(LLNA)

LLNA试验的基本方法是连续3 d在小鼠两耳背上涂抹适当浓度的受试物进行诱导，末次诱导后第3天将放射性同位素标记的胸苷注射入小鼠尾静脉。通常以橄榄油作为对照组进行同样处理，5 h后处死动物，切下两耳旁的淋巴结，制成单细胞悬液，测量细胞每分钟分裂数[10，15]。由于皮肤变态反应在诱导阶段即可引起局部引流的淋巴结T细胞的活化和增殖，T细胞的增殖反应与致敏原的致敏能力呈比例，因此可以通过比较受试物与溶剂对照引起淋巴细胞增殖的剂量反应关系(即刺激指数，stimulation index，SI)评估受试物的致敏能力。通过公式计算SI，若SI≥3，同时存在剂量反应关系者判断为致敏物[16]。

LLNA是根据淋巴结T细胞的增殖程度对受试物致敏性进行定量评价，具有快速、经济、检测指标客观等特点，且该法所用的动物数量较少，试验周期较短，不使用弗氏完全佐剂，减少了动物在试验过程的不舒适感和紧张感，符合动物福利的原则[11，17]。但有研究发现LLNA法会高估了化学物的致敏性，某些无致敏性的化学物质，如表面活性剂、硅聚合物以及多元醇等化学物在传统的豚鼠试验中显示无致敏性，而在LLNA试验中出现了阳性结果[18-19]，因此使用该方法容易出现假阳性的试验结果。

3体外替代试验

2012年，经济合作与发展组织(OECD)将皮肤致敏和诱导的变态反应性接触性皮炎(ACD)命名为预后不良的途径(adverse outcome pathway，AOP)[20]，皮肤致敏AOP机制如图1所示[21]，根据皮肤过敏反应的分子机制和化学物的特性，研究者们利用AOP中的关键事件建立的体外替代试验方法如过氧化物酶肽反应试验(peroxidase peptide reactivity assay，PPRA)、直接肽反应试验(direct peptide reactivity assay，DPRA)、Lusens试验和KeratinosensTM试验、骨髓皮肤致敏试验(Myeloid U937 skin sensitisation test，MUSST)和改良的骨髓皮肤致敏试验(Modified myeloid U937 skin sensitisation test，mMUSST)等均可用于评价化学物的潜在致敏性[22-25]。

图1　皮肤致敏AOP机制Fig.1 The AOP mechanism of skin sensitization

致敏化学物与活细胞皮肤蛋白和肽共价结合形成具有免疫原性的半抗原蛋白结合物(关键事件1)。肽缺失将引起特异性T细胞介导的免疫反应。因此，检测肽和蛋白复合物可以为体外皮肤致敏性试验提供数据。过氧化物酶肽反应试验(PPRA)和直接肽反应试验(DPRA)都是基于关键事件1建立的检测方法，但PPRA法能更好地识别前半抗原[26-27]。DPRA试验对苯胺、十一碳烯酸、α-己基肉桂醛检测的结果为假阴性，并将非致敏物富马酸、葡萄糖、十二烷基硫酸钠、香草醛误检测为致敏物[28-29]。与LLNA试验结果相比，DPRA试验结果的一致性为87.5%，而PPRA试验结果的一致性可达到90%。

KeratinosensTM试验与Lusens试验的检测原理和方法相似，主要是基于关键事件2建立的检测方法。Lusens试验是在ARE启动子(来自NADPH：大鼠基因苯醌氧化还原酶1)的控制下向细胞角质形成细胞插入荧光素酶基因，而KeratinosensTM试验是在ARE启动子(来自人类基因的AKR1 C2)的控制下向细胞角质形成细胞插入荧光素酶基因，但这两种方法都是通过测定荧光素酶的活性和细胞毒性判断该受试物是否能激活角质形成细胞，从而分析该受试物的致敏性[30-32]。值得注意的是，Lusens试验对乙二胺、苯甲酸苯酯、邻苯二甲酸酐检测的结果为假阴性，并将非致敏物4-甲氧基苯乙酮、6-甲基香豆素、水杨酸甲酯、丙基-4-羟苯酸盐、香草醛误检测为致敏物。KeratinosensTM试验对甲基丙烯酸甲酯、氯化镍、苯甲酸苯酯、邻苯二甲酸酐检测的结果为假阴性，并将非致敏物4-甲氧基苯乙酮、6-甲基香豆素、n-己烷、丙基-4-羟苯酸盐、酒石酸、香草醛误检测为致敏物[28-29]。

骨髓皮肤致敏试验(Myeloid U937 skin sensitisation test，MUSST)和改良的骨髓皮肤致敏试验(Modified myeloid U937 skin sensitisation test，mMUSST)均使用的是一种来自骨髓或脐带血中人类组织细胞性白血病细胞系(U937细胞系)[33-35]，该系列试验是基于关键事件3建立的检测方法，用于测量物质活化树突细胞的能力，试验中用流式细胞仪来测量细胞表面标志CD86表达的改变[28]。MUSST试验的特异性为89.7%，其灵敏度和一致性可分别达到86.2%和87.5%，但没有标准的操作程序；而mMUSST试验的特异性较高，可高达97.2%，有标准的操作程序，但该法的灵敏度和一致性较低，分别为62.8%和73.7%，其对肉桂醇、2-苯基丙醛、异丁子香酚、甲基二溴戊二腈、恶唑酮、邻苯二甲酸酐、α-己基肉桂醛检测的结果为假阴性，并将非致敏物氯化镍误检测为致敏物[28-29]。

利用库伯统计学算法[36]，以人体数据为标准进行比较分析，得到LLNA法、DPRA法、Lusens法，KeratinosensTM法、mMUSST法以及两种方法相结合后的灵敏度、特异度、准确度，具体见表1。由数据可知，单个体外替代试验方法的灵敏度、特异度、准确度都不同程度的低于LLNA法，两两结合的试验方法中，只有DPRA和mMUSST结合后的灵敏度、特异度、准确度与LLNA法相当[21，28]。因此，利用上述体外替代试验数据来进行化学物质致敏性评估的能力比较有限。为了提高体外替代试验的灵敏度、特异度、准确度，Bauch等[28]建立了一个新的预测模型，该预测模型主要是利用AOP机制中半抗原蛋白反应(关键事件1)、表皮角质形成细胞(关键事件2)、树突细胞(关键事件3)综合对化学物致敏性进行预测。DPRA法主要是评估肽反应，Lusens法和KeratinosensTM法主要是评估表皮角质形成细胞反应，mMUSST法主要是评估树突细胞反应。利用mMUSST法对受试物进行检测，若检测结果为阳性则认为该受试物为致敏物。利用DPRA法和Lusens法(或KeratinosensTM法)对受试物进行检测，若两种检测结果都是阴性结果则认为该受试物为非致敏物。若mMUSST法检测的结果与DPRA法和Lusens法(或KeratinosensTM法)检测的结果不一致，则需进行“证据加权”，即DPRA法、Lusens法(或KeratinosensTM)和mMUSST法3种试验方法同时检测，若有两种方法的检测结果为阳性结果则认为该受试物为致敏物，若有两种方法为阴性则认为该受试物为非致敏物。采用DPRA法、Lusens法(或KeratinosensTM)、mMUSST法3种方法对受试物的致敏性进行检测，其灵敏度、特异度、准确度分别可高达93%、95%、94%。

表1　几种试验方法检测性能的比较

Maxwell等[37-38]应用皮肤致敏AOP机制建立了两种定量评估化学物皮肤致敏能力的数学模型，分别是总半抗原蛋白模型(total haptenated protein model，tHP model)和CD8+T模型(CD8+T cell response model，CD8+T model)。利用tHP模型预测受试物可能引起表皮和真皮产生的半抗原蛋白的总量，采用CD8+T模型预测受试物致敏作用对皮肤的影响程度，从而可直接量化皮肤上致敏化学物暴露的剂量与特异性半抗原T细胞反应程度之间的剂量-反应关系。综上分析，各类动物皮肤致敏试验均有优缺点，具体见表2。

表2　动物皮肤致敏试验优缺点的比较

4小结

目前化学物皮肤致敏试验多数还是采用传统的整体动物试验、体内外替代试验等方法进行检测，随着大量新型化学物的合成和应用，体外替代试验检测化学物致敏性的方法也逐渐增加，由于其具有快速、经济、高效等特点，应用较为广泛，但目前仍存在较多的不足。虽然利用皮肤致敏AOP机制建立的试验方法多达16种，但多数检测方法尚不成熟，并且体外试验结果外推到体内试验及人群存在一定的安全系数，应用AOP机制建立的两种定量评估化学物皮肤致敏能力的数学模型还需通过人体试验数据和临床收集的数据进一步完善。由于体外替代试验具有快速、经济、高效、应用范围广泛等特点，因此，多种体外替代试验的联合应用将是未来检测化学物是否具有致敏性的主要发展趋势，后期可基于现有的实验数据和人群资料，建立多元化的体内外试验技术集成平台，根据目标检测物的性质和各方法的优缺点，结合试验条件、方法的灵敏度、特异度、与参考标准结果的一致性、方法是否有标准的操作程序以及所检测的物质是否在该试验方法的检测范围内等参数选择合适的检测方法，分析目标检测物的致敏程度。

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(2015-09-01收稿)

中图分类号：R758.2

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.023

*国家自然科学基金资助项目(No.81502792)；湖北省自然科学基金资助项目(No.2014CFB811)

喻才正，男，1992年生，本科生，E-mail：yucaizhenghust@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：skyting1219@126.com