虎杖苷对小鼠急性心肌梗死后心肌细胞损伤的保护作用*

肖召文，　姜　昕，　付　珺，　马　晶，　郑　娜，　刘　杰，　邹松峰，　董　鸣Δ

1深圳大学医学部病理生理学系，深圳　5180602深圳市人民医院老年病科，深圳　5180203武汉市中心医院胸外科，武汉　430014



实验研究

虎杖苷对小鼠急性心肌梗死后心肌细胞损伤的保护作用*

肖召文1#，姜昕2#，付珺3#，马晶1，郑娜1，刘杰1，邹松峰1，董鸣1Δ

1深圳大学医学部病理生理学系，深圳5180602深圳市人民医院老年病科，深圳5180203武汉市中心医院胸外科，武汉430014

摘要：目的探讨虎杖苷对小鼠急性心肌梗死后心肌细胞损伤的保护作用机制。方法结扎小鼠心脏左前降支，建立急性心肌梗死(AMI)模型，分为缺血组和虎杖苷治疗组，另设正常组和假手术组。术后第8天分别检测在体心电图和心脏功能；术后第9天处死各组小鼠行血清肌钙蛋白-T(Troponin-T)检测；行TTC染色、Masson’s Trichrome染色等病理组织学检测；Western blot检测小鼠左心室心肌细胞Rho相关卷曲蛋白激酶(ROCK)活性表达。结果术后第8天在体心电图和超声心动图检测显示虎杖苷治疗组心律失常发生率和心功能较缺血组有明显改善；术后第9天Troponin-T检测表明虎杖苷治疗组血清肌钙蛋白-T水平明显低于缺血组；病理组织学检测显示虎杖苷治疗组心肌纤维化和凋亡程度较缺血组明显降低；Western blot检测提示虎杖苷治疗组ROCK活性较缺血组低。结论虎杖苷可显著抑制心肌细胞缺血后纤维化和细胞凋亡的病理进程，并且对急性心肌梗死后的心脏功能有显著的改善，这种保护机制很可能与虎杖苷抑制急性心肌梗死时升高的ROCK活性相关。

关键词：虎杖苷；急性心肌梗死；Rho相关卷曲蛋白激酶

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)具有突发性、高发病率、高致残率、高致死率等特点，目前尚无任何根治缺血性心肌坏死的药物和疗法。

小G蛋白超家族，尤其是其亚家族成员RhoA及其激酶即Rho相关卷曲蛋白激酶(Rho-associated-coiled-coil protein kinase，ROCK)在调节心脏结构和功能方面发挥着重要的作用[1]。已有研究证实，心肌梗死后RhoA含量及其活性明显增加，血管紧张素2过度激活导致氧化应激增强，同时NOS活性减弱，NO生成减少等，都会影响AMI后心肌收缩和舒张功能。虎杖苷(polydatin，PD)是中药虎杖的有效活性成分，又名虎杖4号或白藜芦醇苷，其化学名为3，4′，5-三羟基芪-3-β-D-单葡萄糖苷(3，4，5-trihydroxystilbene-3-β-mono-D-glucoside)。相关研究表明，虎杖苷对急性心肌梗死模型心肌有明显的保护作用[2]，但其具体机制仍不清楚。本研究旨在探究虎杖苷保护小鼠心肌缺血模型缺血心肌的作用机制。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物SPF级C57小鼠80只，雄性，6～8周龄，体重18～22 g，由深圳大学实验动物中心提供。相关动物实验在深圳大学实验动物中心手术室进行。

1.1.2试剂和仪器1%戊巴比妥钠溶液、LED冷光源(深圳市雷克曼生物技术有限公司)、光学显微镜(Leica)、气管插管针芯(TERUMO)、静脉置留针套管、肋间撑开器、TOPOTM小动物呼吸机(Kent Scientific Torrington，CT.06790，USA)、多道生理信号采集处理系统(RM6240BD，成都)、小动物超声心动图(Vevo 2100 Imaging System，Canada)。虎杖苷由广东海王制药有限公司赠送。一抗pMYPT、MYPT、β-actin和所有二抗均购自Abcam公司(1：1 000)。

1.2实验方法

1.2.1小鼠AMI模型的建立1%戊巴比妥钠溶液按每10 g小鼠体重0.08 mL剂量行腹腔注射麻醉。麻醉成功后胸部备皮，气管插管连接小动物呼吸机，肢体接通多道生理信号采集处理系统进行心电监护。小鼠仰卧位，75%乙醇消毒手术区域，铺无菌手术巾单，自胸骨左缘第4肋间剪开皮肤及皮下组织，钝性分离肌层。眼科剪在近胸骨处稍剪开3、4肋间肌层，肋间撑开器撑开两侧肋骨。破开胸膜，推开胸腺，在肺动脉主干和左心耳交界下方轻轻撕开少许心包，轻压右侧胸廓，充分暴露心脏。以左心耳下缘为标志，平左心耳前下角，沿其边缘寻找冠状动脉左前降支，以8/0无损伤丝线穿过血管，连同少量心肌一同结扎，进针深度控制在0.1 cm左右，宽度在0.10～0.15 cm，彻底止血，结扎瞬间可见小鼠左室前壁失去原有光泽呈现暗灰色或白色，同时结扎线远端心肌活动度减弱或消失。结扎后可见心电图ST段抬高，持续记录心电30 min。逐层关胸，拔掉气管插管。术后仰卧放置、扯出舌头以防窒息。假手术组为开胸后在左前降支部位只穿线不结扎。

1.2.2实验分组手术成功率为100%。取手术成功小鼠40只，随机分为2组，每组20只，分别为缺血组和虎杖苷治疗组。另取正常小鼠20只为正常组，取20只假手术小鼠设假手术组。虎杖苷治疗组术后第2天开始予虎杖苷40 mg/kg每天灌胃1次，连续灌胃治疗7 d。除虎杖苷治疗组外其余各组均以等量0.9%氯化钠注射液灌胃。

1.2.3心电图、小动物超声心动图测量心功能参数术中对各组小鼠分别进行心电图监测，以出现典型ST段抬高作为手术结扎左前降支成功标志。缺血组、虎杖苷治疗组、假手术组和正常组在处死前即术后第8天分别进行心电图、小动物超声心动图测量。

1.2.4血清Troponin-T检测、TTC染色和Masson’s Trichrome染色检测术后第9天处死各组小鼠，提取血清行Troponin-T检测比较心肌缺血性损伤差异；行TTC染色(氯化三苯基四氮唑染色)比较各组心肌梗死面积及形态学差异[3]；行Masson’s Trichrome检测心肌纤维化差异。

1.2.5Western blot检测ROCK活性大量前期研究表明，ROCK活性可以通过检测其下游效应蛋白MYPT磷酸化表达(p-MYPT)来实现。术后第9天分别处死小鼠，取左室心肌组织约100 mg，按100 mg/mL加入全蛋白提取液，加入10 μL PMBS，冰上匀浆30 min，4℃12 000 r/min离心30 min，取上清液20 μL BCA测定蛋白浓度。其余上清液加入等量2×上样缓冲液，于95℃加热5 min，以10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉进行封闭，室温孵育2 h，加入一抗，37℃、60 r/min摇动90 min，弃去一抗，用Tris-HCl缓冲液洗涤3次，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，1：1 000)37℃孵育1 h，弃去二抗，再用Tris-HCl缓冲液洗涤3次。化学发光成像系统(ChemiScope 5300，上海勤翔)显影。

1.3统计学分析

数据采用SPSS 15.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1心电图改变

术后第8天对每组20只小鼠进行心电图(ECG)检测，结果显示缺血组发生显著的病理性Q波、T波倒置和ST段抬高等室性心律失常，共17例；虎杖苷治疗组发生室性心律失常10例，且ST段、T波改变较轻，无病理性Q波出现；正常组和假手术组均未见室性心律失常(图1)。

缺血组可见明显ST段抬高(箭头所示)，而虎杖苷治疗组未见明显ST-T改变图1　术后第8天各组心电图监测Fig.1 Electrocardiogram(ECG)monitoring in each group at 8 days after AMI

2.2心功能指标的测定

术后第8天，小动物超声心动图测定各组小鼠心功能。与正常组比较缺血组左心室射血分数(LVEF)和室间隔舒张末厚度显著降低，差异有统计学意义(均P<0.05)，表明缺血组小鼠心肌均明显受损；而虎杖苷治疗组与缺血组比较LVEF和室间隔舒张末厚度均明显上升，差异具有统计学意义(均P<0.05)(表1)，提示虎杖苷对缺血心肌有明显的保护作用。

2.3血清Troponin-T检测、TTC染色和Masson’s Trichrome染色检测结果

术后第9天处死各组小鼠。行血清Troponin-T检测，虎杖苷治疗组血清Troponin-T水平明显低于缺血组(图2)。TTC染色可见：正常组小鼠心肌组织结构排列正常；缺血组心肌纤维凝固性坏死，出现核碎裂及核消失，肌质均质红染呈不规则粗颗粒状，心肌毛细血管扩张充血，间质轻度水肿可见少量嗜酸性粒细胞浸润，肌原纤维排列紊乱且呈波浪形，间有不规则的横带；虎杖苷治疗组病变有明显改善、梗死区域明显缩小，心肌纤维断裂和肌间质内炎细胞浸润现象较少，充血和水肿等症状基本消失，肌纤维组织结构排列趋于正常组。Masson’s Trichrome染色提示梗死区胶原呈蓝色、正常心肌组织呈红色、细胞核呈褐色，缺血组与虎杖苷治疗组相比，小鼠心肌呈现大片心肌纤维断裂，排列紊乱，心肌细胞坏死，且坏死区域被纤维组织取代(图3)。

图2　各组血清中Troponin-T水平比较Fig.2 The expression of Troponin-T in the serum in each treatment group

实验分组左室舒张末内径(mm)左室收缩末内径(mm)室间隔舒张末厚度(mm)左室射血分数(LVEF,100%)左室缩短分数(LVFS,100%)正常组3.66±0.652.42±0.421.23±0.1170.65±13.2143.32±5.65缺血组4.56±0.34*3.61±0.54*0.86±0.08*45.23±15.87*18.26±3.65*虎杖苷治疗组3.72±0.45#2.76±0.37#0.94±0.16#60.36±16.32#35.98±4.43#假手术组3.54±0.252.52±0.321.24±0.0971.15±12.7840.54±4.76

与正常组比较，*P<0.05；与缺血组比较，#P<0.05

2.4Western blot检测p-MYPT蛋白激酶的表达

Western blot检测提示，虎杖苷明显降低了磷酸化的MYPT(p-MYPT)在AMI中的含量，提示虎杖苷治疗组ROCK活性降低。各组MYPT总蛋白含量则无变化(图4)。

3讨论

在心脑血管系统，虎杖苷通过改善血液流变学、抗血栓形成、抗氧化、影响离子通道、调节蛋白激酶和一氧化氮(Nitric oxide，NO)等方式发挥抗心肌缺血/再灌注、保护心肌、抗缺血性脑损伤、改善学习记忆、抗脑出血损伤、抗动脉粥样硬化等作用[4-7]。王月刚等[8]通过体外心肌细胞缺血缺氧模型得出虎杖苷对缺血缺氧作用下的心肌有保护作用，其机制可能是通过调节蛋白激酶(PKC)的活性来发挥作用。金春华等[9]用体外培养的大鼠心肌细胞观察到虎杖苷可以增加心肌的收缩幅度，增强心肌收缩力，其作用大小与临床上常用的强心药西地兰相似。张松涛等[10]通过建立大鼠体外心脏缺血/再灌注(I/R)模型研究虎杖苷对I/R心脏血流动力学和生化指标以及对超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影响，结果反映出虎杖苷具有明显的恢复心脏供血、加强收缩力等功能，能增加机体清除氧化自由基的能力，通过激发抗氧化作用，减轻心肌细胞损伤，发挥心肌保护作用。本研究通过结扎小鼠冠状动脉左前降支，阻断其分布区域的心肌供血，制成心肌缺血梗死模型。实验表明：虎杖苷能显著拮抗由冠脉结扎引起的心律失常(图1)；能显著改善缺血心脏的心功能，提高虎杖苷治疗组的左室射血分数(表1)。由此可见，虎杖苷具有较强的生物活性，对心肌梗死及其继发的心律失常和心肌细胞纤维化和凋亡起着重要的保护作用，但其作用机制未见报道。

A、B和C分别为正常组、缺血组和虎杖苷治疗组心肌组织TTC染色大体观；D、E和F分别为正常组、缺血组和虎杖苷治疗组心肌组织Masson’s Trichrome染色切片图(×20)图3　各组心肌大体解剖及组织染色切片图Fig.3 Gross examination and histological staining of myocardial tissues in each group

图4　Western blot检测各组p-MYPT及MYPT的表达Fig.4 The expression of p-MYPT and MYPT in each group

本研究中，血清Troponin-T检测提示虎杖苷可明显降低血清Troponin-T水平，对缺血性心肌起明显的保护作用(图2)。病理组织学检查发现虎杖苷在AMI中可明显抑制心肌细胞纤维化和凋亡(图3)。Western blot检测提示，虎杖苷显著降低RhoA/ROCK信号通路下游靶蛋白p-MYPT(磷酸化MYPT)在AMI中的活性(图4)。可见，在缺血损伤后，缺血心肌RhoA表达上调，ROCK活性增加。而虎杖苷可抑制ROCK活性，从而引起冠脉平滑肌松弛，改善冠脉狭窄区域心肌血流量，抑制心肌细胞纤维化和凋亡，缓解心肌细胞电生理的不均一性从而降低不同类型心律失常的发生。

综上所述，虎杖苷极有可能是通过抑制升高的ROCK活性达到对心肌梗死后心肌的保护作用。这种抑制，既可能是直接对激酶的抑制也可能是对ROCK上游的抑制，对于其具体作用机制和靶点，还有待进一步的实验揭示。

本研究探讨了虎杖苷对心律失常和心肌缺血的保护作用，初步揭示了虎杖苷对小鼠急性心肌梗死所致心律失常、心肌凋亡和心肌纤维化的保护作用机制。提示虎杖苷及其化学结构改造产物有望成为抗心律失常及抗心肌缺血的潜在药物，为进一步研究其临床应用价值奠定了基础。

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(2015-08-07收稿)

Polydatin Protects Myocardiocytes from Acute Myocardial Infarction Injury in Mice

Xiao Zhaowen1#，Jiang Xin2#，Fu Jun3#etal

1DepartmentofPathophysiology，HealthSciencesCenter，ShenzhenUniversity，Shenzhen518060，China；2DepartmentofGeriatrics，ShenzhenPeople’sHospital，Shenzhen518020，China3DepartmentofThoracicSurgery，WuhanCentralHospital，Wuhan430000，China

AbstractObjectiveTo investigate the protective effect of polydatin against acute myocardial infarction(AMI)and the underlying mechanism.MethodsAMI models were established in C57 mice by ligating the left anterior descending coronary artery.Animals were randomly divided into four groups：normal group(NC group)，AMI group(AMI group)，polydatin treatment group(AMI+PD group)and sham group.Echocardiography and electrocardiogram were performed 8 days after operation.Nine days after the operation the animals were sacrificed for detection of serum Troponin-T levels.Tetrazolium(TTC)staining and Masson’s Trichrome staining were used for detection of pathological changes and Western blot to measure the expression of Rho-associated-coiled-coil protein kinase(ROCK)in myocardiocytes in mouse left ventricule.ResultsEchocardiography and electrocardiogram showed polydatin could significantly improve the incidence of arrhythmia and the cardiac function when compared with AMI group.The expression level of Troponin-T was much lower in AMI+PD group than in AMI group at 9 days after operation.Histopathological examination showed that myocardial fibrosis and apoptosis were significantly reduced in AMI+PD group than that in AMI group.The ROCK activity was significantly lower in AMI+PD group than that in AMI group.ConclusionPolydatin can inhibit the development of fibrosis and apoptosis after myocardial ischemia and significantly improve the cardiac function.The protective mechanism may involve the inhibitory effect of polydatin on the increased activity of ROCK in AMI.

Key wordspolydatin；acute myocardial infarction；Rho-associated-coiled-coil protein kinase

中图分类号：R541.4

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.012

*国家自然科学基金资助项目(No.81202529)；2013年度深圳市科技计划项目(医疗卫生类)(No.201302032)

#同为第一作者

肖召文，男，1974年生，主治医师，医学硕士，E-mail：1337626275@qq.com；姜昕，女，1974年生，主任医师，医学博士，E-mail：jiangxinsz@163.com；付珺，男，1979年生，主治医师，医学学士，E-mail：007fj@sina.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：dongm@szu.edu.cn