P2X2受体在颞叶癫痫发病机制中的作用*

刘　艳，　宋鹏辉，　唐迎春，　张宇星，　詹　莉，　胡亚丹，　朱明秋，　邓学军△

1武汉市第八医院神经内科，武汉　4300102华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，武汉　430022



P2X2受体在颞叶癫痫发病机制中的作用*

刘艳1，宋鹏辉2，唐迎春1，张宇星1，詹莉1，胡亚丹1，朱明秋1，邓学军2△

1武汉市第八医院神经内科，武汉4300102华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，武汉430022

摘要：目的通过研究P2X2受体(嘌呤受体)蛋白在颞叶癫痫大鼠脑组织中的表达水平及星形胶质细胞的增殖水平，以及应用P2X2受体拮抗剂亮蓝G(Brilliant Blue G，BBG)后对颞叶癫痫的影响，探讨P2X2受体在颞叶癫痫发病机制中的作用。方法应用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射建立SD大鼠颞叶癫痫模型，将大鼠分为正常盐水对照组、急性发作组、慢性自发性发作组；其中慢性自发性发作组又分为空白对照组(生理盐水)和亮蓝G干预组，应用免疫组化检测各组大鼠海马区P2X2受体及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达水平，GFAP反映星形胶质细胞的增殖水平。结果免疫组化检测发现，P2X2受体主要表达于大鼠海马组织的CA1、CA3、齿状回、门区，并且在丘脑也有一定的表达；P2X2受体及GFAP在慢性自发性发作空白对照组中的表达明显高于正常盐水对照组和急性发作组(P<0.05)；而亮蓝G干预组与慢性自发性发作空白对照组相比，P2X2受体及GFAP表达水平明显降低(P<0.05)。结论P2X2受体可能在颞叶癫痫的发病机制中有重要作用，阻滞P2X2受体可能是治疗颞叶癫痫的潜在靶点。

关键词：颞叶癫痫；P2X受体；亮蓝G；胶质纤维酸性蛋白；匹罗卡品

癫痫是中枢神经系统最常见的发作性疾病，中国有癫痫患者约900万，其中难治性癫痫占25%左右，全国的难治性癫痫患者至少有200万人以上。1972年，“嘌呤受体”的概念由Burn-stock首次提出，用于描述细胞膜腺苷受体和三磷酸腺苷(ATP)受体。根据国际药理协会(IuPHAR)1998年对受体和药物的分类命名目录，对胞外腺苷敏感的受体称为P1，对胞外核苷酸敏感的受体称为P2，前者属G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors，GPcRs)家族，包括A1、A2a、A2b、A3四类；后者包括P2X和P2Y两类，其中P2Y属G蛋白偶联受体家族，而P2X则属于配体ATP门控的离子通道(ligand-gated ion channels，LGIcs)，当胞外ATP结合P2X受体时，P2X通道打开，允许阳离子通过。在哺乳动物细胞内，有5个P2Y(P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11)和7个P2X2受体已被克隆并阐明其药理学特性[1]。

既往研究通过原位杂交和免疫组化技术证实P2X2受体在大鼠中枢神经系统(CNS)有广泛而大量的分布。P2X2受体具有多种生理功能，包括调控神经递质的释放，刺激细胞因子、趋化因子的表达和释放，参与炎性反应和免疫反应，诱导细胞损伤甚至凋亡等[2-3]。大量研究证实神经递质异常与炎性免疫反应均参与颞叶癫痫的发病机制，因此我们推测P2X2受体可能是颞叶癫痫发病的上游机制。本研究通过检测各组大鼠颞叶癫痫模型海马脑组织中的P2X2受体表达水平及星形胶质细胞的增殖水平，以探讨P2X2受体在颞叶癫痫发病机制中的可能作用。

1材料与方法

1.1实验动物

SD雄性大鼠90只，体重范围为200～250 g，所有大鼠来源于华中科技大学同济医学院实验动物学部。饲养环境标准：温度维持在24℃～25℃，湿度维持在50%～60%，12 h昼夜交替，并保证充足的饮用水以及饲料供应。

1.2实验药物

抗P2X2受体抗体(购自Abcam公司)；抗GFAP受体抗体(购自Abcam公司)；亮蓝G(Brilliant Blue G，购自Sigma-Aldrich公司)；氯化锂(购自Sigma-Aldrich公司)；盐酸匹罗卡品(购自Sigma-Aldrich公司)；硫酸阿托品针剂(购自中国上海禾丰制药有限公司)；安定针剂(购自中国天津制药有限责任公司)；10%水合氯醛(购自中国武汉协和医院药剂科)。生理盐水(购自中国青岛华仁药业有限公司)溶解氯化锂粉剂以及盐酸匹罗卡品粉剂，水溶物于室温隔光保存。

1.3大鼠颞叶癫痫动物模型制备

给予大鼠腹腔注射氯化锂预处理(127 mg/kg)，17.5 h后，腹腔注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，0.5 h后，腹腔注射匹罗卡品(15 mg/kg)。癫痫的发作严重程度参照Racine分级标准划分为5个等级：①面部及口部运动；②具有节奏的规律性点头运动；③前肢的阵挛运动；④前肢的阵挛运动以及后肢阵挛及站立；⑤大鼠旋转、全身阵挛及左右摇晃跌倒。模型建立成功的标准为大鼠发作等级必须达到≥4级的分级标准。若大鼠癫痫发作严重程度<4级，则按30 min的时间间隔以及15 mg/kg的标准再次注射匹罗卡品水溶液。若经4次注射匹罗卡品后(总剂量为60 mg/kg)，大鼠仍未达到≥4级的发作，则不再注射。成功诱发癫痫持续状态的大鼠，在其癫痫持续状态到达1 h后，则腹腔注射安定(10 mg/kg)终止癫痫持续状态。诱发癫痫持续状态的大鼠在24 h后进入潜伏期。

1.4动物分组

90只SD雄性大鼠，其中6只腹腔注射生理盐水而非匹罗卡品，作为正常盐水对照组，剩余84只大鼠分批建立颞叶癫痫模型，根据模型制作后癫痫发作的情况分为急性发作组和慢性自发性发作组，慢性自发性发作组又分为空白对照组(生理盐水)和亮蓝G干预组。

1.5脑电图监测

大鼠经腹腔注射水合氯醛后，经束缚固定于操作台上，2枚针灸针作为电极，插入与颞叶相对的头皮处(位于内耳门前方0.65 cm，中线旁0.4 cm)，参考电极置于两眼外眦连线之间的皮下。脑电图信号经0.53 Hz及30 Hz的频率滤波后，输入脑电信号采集系统。所有大鼠均行脑电图监测以记录脑电波形(每周1次，每次2～4 h)。

1.6行为学观察

成功诱发癫痫持续状态的大鼠，15 d后行24 h视频脑电图监测，以确认其是否有慢性自发性发作的行为学表现。行为学观察参数为：自急性发作至出现慢性自发性发作的潜伏期、癫痫发作频率、慢性自发性发作潜伏期内大鼠的死亡比例等。

1.7免疫组化检测

免疫组化染色采用SABC法。梯度乙醇脱蜡后用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。随后用0.3%H2O2水溶液作用15 min封闭内源性过氧化物酶活性，采用山羊血清封闭20 min(室温)，加入一抗(1：500)，4℃温盒内过夜，其后步骤按试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照。每张切片在同一放大倍数(×400)、同一光强度下拍摄，经灰度调节后用Image-Pro Plus 6.0测量切片上阳性反应物的平均吸光度值，用平均吸光度值表示阳性颗粒表达强度。

1.8统计学分析

2结果

2.1脑电图

该实验采用定量脑电图的方法统计各组大鼠的棘波发放数目。盐水对照组的脑电图波形主要以α波(8～10 Hz，20～120 μV)为主，并伴有低幅度的β波及少量的δ波。在出现慢性自发性发作的28只大鼠中，有24只大鼠的脑电图出现较为规律的棘波发放，其频率多集中于28 Hz，波幅不高于200 μV。急性发作组及亮蓝G干预组的脑电图特点为在各个簇状棘波发放的波形后存在平直线性波形。而盐水对照组几乎未捕捉到棘波发放；在慢性自发性发作组大鼠的脑电图中(图1)，少见簇状棘波发放以后的平直线性波形。

图中箭头指棘波图1　慢性自发性发作组典型脑电图记录Fig.1 Typical electroencephalogram of chronic spontaneous epileptic seizure

2.2行为学观察结果

腹腔注射匹罗卡品后，大鼠出现明显的行为学异常，包括口部运动、点头运动、湿狗样抖动。模型建立过程中，4只(4/84)在注射药品时死亡；63只(63/84)成功诱发癫痫持续状态，诱发癫痫持续状态的63只大鼠中，13只(13/63)由于未能有效终止癫痫持续状态而死亡；84只中，有17只(17/84)未能诱发癫痫持续状态。成功诱发癫痫急性发作的50只大鼠中，采用随机方法选取6只(6/50)予以急性期处死，作为急性发作组；剩余的44只大鼠进入潜伏期，有7只(7/44)在潜伏期内死亡。经过(33.0±6.5)d[3]的潜伏期后，有9只(9/37)没有出现慢性自发性发作；剩余的28只(28/37)大鼠在视频检测中出现慢性自发性发作，将这28只大鼠归为慢性自发性发作组，并将这28只大鼠中18只(18/28)设为亮蓝G干预组、10只(10/28)为空白对照组。其中亮蓝G干预组分为50 mg组6只(6/18)、100 mg组6只(6/18)、200 mg组6只(6/18)，同样空白对照组也分为50 mg组3只(3/10)、100 mg组3只(3/10)、200 mg组4只(3/10)。本实验室以往的研究发现大部分成功诱发癫痫急性发作的大鼠在(33.0±6.5)d时出现慢性自发性发作，本实验也观察到类似的结果，与以往实验相似[3]。

2.3大鼠免疫组化检测结果

2.3.1P2X2受体在各组大鼠海马组织中的表达水平P2X2受体在各组大鼠脑组织中均有一定的表达，并主要分布于CA1、CA3、齿状回及门区，在丘脑也有少量的表达(图2)。

2.3.2胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在各组大鼠海马组织中的表达水平GFAP的表达水平反映星形胶质细胞的增殖水平，实验结果显示星形胶质细胞在癫痫急性发作组及慢性自发性发作组中均有较多增殖，在亮蓝G干预组增殖减低(图3)。

3讨论

既往研究表明，在全身多种组织、系统中，都可以检测到P2受体的存在。P2X受体的研究伊始，仅仅局限于药理学方面，直到20世纪中期，随着研究的深入，7种P2X受体亚基被克隆，关于它的研究便越来越多。P2X受体广泛分布于全身的各组织，不同的亚基类型分布在中枢神经系统、免疫系统，以及以平滑肌细胞为主的多个组织部位[4-5]。通过Northern blot和原位杂交技术等研究显示P2X各受体亚型mRNA多表达在背根神经节、结状神经节和三叉神经节中[6-7]。其中P2X2在大脑皮层、海马、缰核、黑质致密部、下丘脑腹正中核和弓形核视上核以及室旁核、三叉神经中脑核、腹外侧核、迷走神经背核和孤束核等部位均有大量表达[8]。

本实验研究显示，P2X2受体在各组大鼠的海马组织中均有一定程度的表达。免疫组化检测显示，成功诱发癫痫发作的大鼠，P2X2受体主要表达于CA1、CA3及门区，在丘脑也有一定程度的表达。P2X2受体在慢性自发性发作空白对照组的表达水平明显高于其他各组。与之对应的脑电图监测记录发现慢性自发性发作组中棘波发放数目明显多于其他各组。亮蓝G(Brilliant Blue G)是一种新型的生物染色剂，可以阻断P2X2受体，且无明显生物毒性，近来被广泛应用于P2X2受体相关研究中[9]。在亮蓝G干预组中脑电图记录棘波发放数目减少，视频监测其癫痫发作次数减少，而免疫组化检测显示P2X2受体及GFAP的表达水平较相应剂量盐水空白对照组为低，且与亮蓝G剂量呈负相关。同时提示P2X2受体的表达水平与星形胶质细胞的增殖程度有着相类似的趋势。本研究结果显示，在癫痫的慢性自发性发作期，给予大鼠亮蓝G处理可减少大鼠自发性癫痫发作，可减少大鼠脑组织P2X2受体及星形胶质细胞的增殖。因此，可推论P2X2受体通路在癫痫急性发作后有轻度的表达上调，而癫痫反复发作的原因也极有可能与在癫痫急性发作后导致P2X2受体的表达失控相关[10-11]。

a：正常盐水对照组；b：急性发作组；c：50 mg盐水空白对照组；d：亮蓝G 50 mg干预组；e：100 mg盐水空白对照组；f：亮蓝G 100 mg干预组；g：200 mg盐水空白对照组；h：亮蓝G 200 mg干预组；c～h属于慢性自发性发作组，图中箭头指示染色后的P2X2受体。A：癫痫慢性自发性发作空白对照组P2X2受体表达水平明显高于正常盐水对照组和急性发作组(*P<0.05)；B：亮蓝G干预组P2X2受体水平与慢性自发性发作空白对照组相比明显降低(*P<0.05 **P<0.01)图2　免疫组化检测各组大鼠海马CA3区P2X2受体表达水平(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of P2X2 receptor in the CA3 region of rat hippocampus(×400)

a：正常盐水对照组；b：急性发作组；c：50 mg盐水空白对照组；d：亮蓝G 50 mg干预组；e：100 mg盐水空白对照组；f：亮蓝G 100 mg干预组；g：200 mg盐水空白对照组；h：亮蓝G 200 mg干预组；c～h属于慢性自发性发作组，图中箭头所示为染色的星形胶质细胞。A：癫痫慢性自发性发作空白对照组GFAP表达水平明显高于正常盐水对照组和急性发作组(*P<0.05)；B：亮蓝G干预组GFAP表达水平与慢性自发性发作空白对照组相比明显降低(*P<0.05 **P<0.01)图3　免疫组化检测各组大鼠海马CA3区GFAP表达水平(×400)Fig.3 Immunohistochemical staining of GFAP in the CA3 region of rat hippocampus(×400)

综上所述，本研究结果提示，P2X2受体通路可能参与了颞叶癫痫的发病机制，且亮蓝G可能对P2X2受体通路有轻度的阻滞作用。免疫组化分析作为一种半定量分析，具有一定的局限性，且亮蓝G并非P2X2受体特异性拮抗剂，而P2X2受体通路如何诱导了星形胶质细胞的增殖而参与了颞叶癫痫的发病机制尚有待更深入的研究。

参考文献

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(2015-11-22收稿)

Role of P2X2 Receptor in the Pathogenesis of Temporal Lobe Epilepsy

Liu Yan1，Song Penghui2，Tang Yingchun1etal

1DepartmentofNeurology，TheEighthHospitalofWuhan，Wuhan430010，China2DepartmentofNeurology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo explore the role of P2X2 receptor in the development of temporal lobe epilepsy by examining the expression levels of P2X2 in brain tissues of rats with temporal lobe epilepsy，the astrogliosis and the effect of brilliant blue G(BBG)，a P2X2 receptor antagonist，on temporal lobe epilepsy.MethodsThe models of temporal lobe epilepsy were established by intraperitoneal injection of LiCl-pilocarpine into SD rats.The animals were divided into normal saline control group，acute epileptic seizure group and chronic spontaneous seizure group(including blank control subgroup and BBG subgroup).The expression levels of P2X2 receptor and glial fibrillary acidic protein(GFAP)were detected in hippocampal tissues by immunohistochemistry.ResultsThe P2X2 receptor was found to mainly express at CA1，CA3，dentate gyrus and hilus in the hippocampus，as well as in the hypothalamus.The expression levels of P2X2 receptor and GFAP were significantly increased in the blank control subgroup as compared with those in normal saline control group and acute epileptic seizure group(P<0.05).They were profoundly decreased in BBG subgroup when compared with those in blank control subgroup(P<0.05).ConclusionThe P2X2 receptor may play an important role in the development of temporal lobe epilepsy，and it may become a potential therapeutic target for temporal lobe epilepsy.

Key wordstemporal lobe epilepsy；P2X2 receptor；brilliant blue G；glial fibrillary acidic protein；pilocarpine

中图分类号：R742.1

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.007

*武汉市卫计委临床医学科研项目(No.WX14A09)

刘艳，女，1971年生，主任医师，E-mail：miss8670@126.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：dengxuejun1965@126.com