FAM96B基因在结肠癌组织中低表达且抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡*

蔡　逊，　马丹丹△，　田　俊，　张智勇，　金炜东

1广州军区武汉总医院普通外科，武汉　4300702华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学与分子生物学系，武汉　430030



FAM96B基因在结肠癌组织中低表达且抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡*

蔡逊1，马丹丹1△，田俊2，张智勇1，金炜东1

1广州军区武汉总医院普通外科，武汉4300702华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学与分子生物学系，武汉430030

摘要：目的观察96序列相似的家庭成员B(family with sequence similarity 96，member B，FAM96B)在56例结肠癌组织中的表达，并探讨其对结肠癌细胞系HCT-116细胞增殖及凋亡的影响。方法分别采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)及Western blot检测56例结肠癌肿瘤组织和癌旁组织中FAM96B的mRNA及蛋白表达水平。构建含人FAM96B全长序列的pcDNA3.1-myc-FAM96B重组质粒，并通过脂质体质粒转染人结肠癌细胞系HCT-116细胞，采用噻唑蓝(MTT)法检测FAM96B过表达对HCT-116增殖能力的影响，采用流式细胞技术检测其对细胞周期和凋亡的影响。结果在56例结肠癌组织中，FAM96B mRNA在肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织(P<0.05)。FAM96B蛋白在肿瘤组织中的表达同样低于癌旁组织(P<0.05)。MTT细胞实验结果表明FAM96B组吸光度(A)值显著低于对照组(P<0.05)，即过表达FAM96B可抑制HCT-116细胞增殖。流式细胞仪检测结果显示过表达FAM96B组的细胞凋亡率高于对照组[(44.70±1.12)% vs.(4.30±0.91)%，P<0.05)。细胞周期分析显示，过表达FAM96B组在G1期的细胞百分数[(51.58±0.97)%]显著低于对照组[(62.64±0.87)%，P<0.05]，S期的细胞百分数[(35.35±0.58)%]显著高于对照组[(25.79±0.74)%，P<0.05]。结论FAM96B在结肠癌组织中低表达，过表达FAM96B可抑制结肠癌细胞系HCT-116增殖且诱导其凋亡。FAM96B可能作为一个潜在抑癌基因直接参与结肠癌发生、发展过程，并有可能成为结肠癌新的抗癌靶点。

关键词：96序列相似的家庭成员B；结肠癌；细胞增殖；细胞凋亡

结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，目前其在我国的发病率和死亡率均呈逐年上升趋势[1-2]。大规模基因水平研究发现，结肠癌的发生发展与众多基因、分子的异常表达有关[3-4]。96序列相似的家庭成员B(family with sequence similarity 96，member B，FAM96B)，亦称MIP18、CGI-128或HSPC118。编码163个氨基酸，包含5个外显子，染色体定位在16q22.1～q22.3，分子量为18×103[5]。目前国内外关于FAM96B功能研究的报道甚少。最新研究发现，FAM96B可能参与血管内皮细胞增殖、迁移及微管形成，并在细胞有丝分裂和凋亡中发挥作用，且抑制肝癌的发生发展[6-8]。但是FAM96B在结肠癌发生发展中的功能尚未见报道。本研究采用real-time PCR、Western blot等技术检测FAM96B在人结肠癌组织中的表达情况，探讨其在结肠癌发生发展中的生物学功能，以期为寻找结肠癌新的靶向治疗靶点提供有力依据。

1材料与方法

1.1组织标本的采集与处理

56例人结肠癌肿瘤组织和配对的癌旁组织标本取自2014年3月至2015年3月期间在广州军区武汉总医院普通外科手术治疗的结肠癌患者。所有标本均经本院病理科诊断证实。癌旁组织标本取自至少距肿瘤边缘2 cm处，所有标本离体后立即置入液氮中保存。所有标本的获取均征得患者本人及家属同意，并通过本院伦理委员会批准。

1.2主要试剂

兔抗人FAM96B单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗均购自Abcam公司；细胞凋亡检测试剂盒及细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物公司；DMEM高糖培养液、胎牛血清(FBS)、0.05%胰蛋白酶及噻唑蓝(MTT)均购自Sigma公司；Trizol试剂盒、逆转录试剂盒及Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；总蛋白抽提试剂盒、质粒提取试剂盒、化学发光试剂盒及蛋白浓度检测试剂盒均购自Tiangen公司。人结肠癌细胞系HCT-116细胞保存于本院中心实验室。pcDNA3.1-myc-FAM96B质粒由华中科技大学同济医学院基础医学院田俊教授惠赠。FAM96B引物及β-actin引物见表1，均由上海英骏生物工程技术服务公司设计并合成。

表1　各引物序列

1.3Real-time PCR检测FAM96B mRNA表达

采用Trizol试剂盒提取56例结肠癌患者的肿瘤组织及配对癌旁组织的总mRNA，以紫外分光光度仪检测其吸光度值(A260 nm/A280 nm值为1.8～2.0为理想值)，计算其浓度以便指导逆转录模板的需要量。接着用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，保存于-80℃冰箱备用。所有操作步骤均按照说明书进行。Real-time PCR总反应体系为20 μL：2×SYBR Green mix缓冲液10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.6 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.8 μL。反应参数为：94℃预变性2 min；94℃变性20 s，58℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40个循环；72℃终延伸5 min。每个样本均设3个复孔，并重复3次。各组中FAM96B的相对表达量通过2-ΔΔCt法进行计算。

1.4Western blot检测FAM96B蛋白表达

分别称取0.1 g结肠癌肿瘤组织和癌旁组织，加800 μL全蛋白提取液(放射免疫沉淀裂解液，RIPA)，含10%蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)提取蛋白。采用Bradford法进行蛋白定量。各组150 μg上样于5.0%浓缩胶，15%分离胶，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离。电泳结束后转移蛋白于PVDF膜，加5%脱脂奶粉稀释的一抗FAM96B及β-actin(1∶500稀释)封闭，4℃过夜，加HRP标记二抗(1∶5 000稀释)，37℃条件温育2 h，化学发光法显影检测。

1.5MTT法检测HCT-116细胞活性

取对数生长期的HCT-116细胞以5×103个细胞/孔接种于无菌96孔板(100 μL/孔)，24 h后进行转染，分为FAM96B组(转染目的基因FAM96B的质粒，pcDNA3.1-myc-FAM96B)和对照组(转染空白质粒，pcDNA3.1-vector)，每组设3个复孔。细胞于含10%FBS的DMEM培养液中培养1～4 d，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，继续孵育1 h。吸弃各孔内上清液，每孔加150 μL DMSO，在酶标仪上检测490 nm的各孔吸光度(A)值，以时间为横坐标，A值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.6流式细胞仪检测HCT-116细胞周期及凋亡

胰酶消化细胞，离心弃上清，70%冰乙醇固定过夜，低速离心弃乙醇，加入1 mL PBS和Rnase A，室温放置1 h后，加1 mL PI(100 mg/L)，避光反应30 min后，应用流式细胞仪检测细胞周期。将各组细胞用胰酶消化，用1×PBS洗涤细胞2次，2 000 r/min、5 min，离心收集5×105个细胞。将细胞移入新的1.5 mL离心管，加500 μL 1×Binding Buffer结合缓冲液悬浮细胞，加5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI混匀。室温避光孵育15 min，30 min内用流式细胞仪检测FITC，利用Cell Quest软件获取并分析细胞凋亡率。相同条件下本实验重复3次。

1.7统计学方法

2结果

2.1Real-time PCR及Western blot检测FAM96B在结肠癌中的表达

在56例结肠癌组织中，FAM96B mRNA在肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织[(1.22±0.14)vs.(0.43±0.08)，P<0.05]。FAM96B蛋白在肿瘤组织中的表达同样低于癌旁组织(P<0.05)(图1)。

图1　FAM96B在结肠癌组织及相应癌旁组织中的蛋白表达Fig.1 The protein expression of FAM96B in colorectal carcinoma tissues and their adjacent non-tumor tissues

2.2MTT法检测HCT-116细胞活性

图2所示为FAM96B组(转染目的基因FAM96B的质粒，pcDNA3.1-myc-FAM96B)和对照组(转染空白质粒，pcDNA3.1-vector)的HCT-116细胞的生长曲线，横坐标代表检测时间点，纵坐标代表吸光度(A)值。MTT细胞实验结果表明：FAM96B组吸光度值显著低于对照组(P<0.05)，即过表达FAM96B可抑制HCT-116细胞增殖。

与对照组比较，*P<0.05图2　HCT-116细胞生长曲线Fig.2 The growth curve of HCT-116 cells

2.3流式细胞仪检测HCT-116细胞周期和凋亡率

如图3细胞周期检测结果所示：过表达FAM96B组在G1期的细胞百分数(51.58±0.97)%显著低于对照组(62.64±0.87)%(P<0.05)，S期的细胞百分数(35.35±0.58)%显著高于对照组(25.79±0.74)%(P<0.05)。提示过表达FAM96B可抑制HCT-116细胞增殖，细胞周期主要阻滞在G1期。

如图4所示：过表达FAM96B组的细胞凋亡率高于对照组[(44.7±1.12)%vs.(4.3±0.91)%，P<0.05]，表明过表达FAM96B可显著诱导HCT-116细胞凋亡。

图3　过表达FAM96B对HCT-116细胞周期的影响Fig.3 The effect of FAM96B overexpression on HCT-116 cell cycle

3讨论

FAM96B是由163个氨基酸组成的分子量为18×103的小分子蛋白。目前国内外关于FAM96B的研究甚少。荆霞等[9]发现FAM96B与内皮细胞的功能和冠心病的发生密切相关。Yang等[6]发现FAM96B作为碱性螺旋-环-螺旋蛋白E2-2的调节基因，它能抑制E2-2的蛋白表达，而E2-2蛋白能够抑制血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的启动子活性[10]，提示FAM96B基因促进血管内皮细胞增殖、迁移及微管形成。上述资料有力地证明了FAM96B在细胞的增殖、迁移中可能具有重要的生物学意义。

Q1：机械性损伤细胞；Q2：晚期凋亡或坏死细胞；Q3：正常细胞；Q4：早期凋亡细胞图4　过表达FAM96B对HCT-116细胞凋亡的影响Fig.4 The effect of FAM96B overexpression on HCT-116 cell apoptosis

目前关于FAM96B与结肠癌发生发展关系的研究国内外尚未见报道。在本研究中，我们选取56例结肠癌患者的肿瘤组织和相应的癌旁组织，通过real-time PCR检测FAM96B mRNA的表达，发现FAM96B基因在肿瘤组织中的表达显著低于相应癌旁组织，同时我们采用Western blot技术检测FAM96B蛋白表达，发现同样的现象。即FAM96B在肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织，这种表达差异提示了FAM96B过表达在结肠癌发生、发展中可能的作用。

目前，基因克隆、基因转染是公认的明确基因功能的主要手段[11]。因此，为进一步研究FAM96B对结肠癌细胞的直接效应，我们利用已构建的FAM96B真核过表达载体转染结肠癌细胞系HCT-116细胞来研究FAM96B基因过表达对细胞功能的影响。本研究中，MTT实验结果显示：FAM96B组HCT-116细胞的增殖速度显著低于对照组，提示过表达FAM96B抑制HCT-116细胞增殖。细胞周期分析结果表明：FAM96B组中G1期的细胞百分数显著低于对照组，但S期的细胞百分数显著高于对照组。提示过表达FAM96B可将HCT-116的细胞周期静止在G1期，致使进入有丝分裂的细胞数明显减少，阻断DNA的合成，从而细胞增殖受到抑制[12]。因此，推测FAM96B在结肠癌中的表达可抑制肿瘤细胞增殖。

Ito等[7]报道FAM96B与MMS19、Ciao1、XPD等组成蛋白复合物MMXD(MMS19-FAM96B-XPD)，在有丝分裂中，定位于纺锤体，促进染色体正常分离。沉默FAM96B可导致结肠癌细胞系HCT-116细胞不能正常有丝分裂，致使异型细胞核堆积。Janssen等[13]发现，在细胞有丝分裂过程中，染色体不稳定，反复获得和缺失染色体，可导致染色体错误分离率增加，致使大多数的细胞分裂会产生异常的非整倍体细胞，细胞分裂异常，产生不可能生存的后代，即多核细胞，进而诱导细胞凋亡。上述资料提示FAM96B与细胞凋亡密切相关。本研究经流式细胞仪检测证实过表达FAM96B可显著诱导HCT-116细胞凋亡，与国外文献报道相一致。

本研究结果有力地证实：FAM96B基因在结肠癌肿瘤组织低表达，且抑制结肠癌细胞的增殖，并促进其凋亡，因此FAM96B基因抑制结肠癌的发生发展。目前，国内外学者虽然对FAM96B基因的研究已经取得一些进展，但还有许多的未知领域需要我们更加广泛和深入的研究，如：FAM96B对其他肿瘤细胞系是否有同样的促凋亡抑增殖的功能，在其他肿瘤组织中的表达、FAM96B的亚细胞定位以及FAM96B基因沉默对细胞生物学功能的影响等。相信随着研究的不断深入，FAM96B的功能研究将得到突破性进展。

参考文献

[1]Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012[J].CA，2012，62(1)：10-29.

[2]吴阶平，裘法祖.黄家驷外科学[M].北京：人民卫生出版社，2000：115.

[3]Provenzale D，Jasperson K，Aslanian H，et al.Colorectal cancer screening，version 1.2015[J].J Natl Compr Canc Netw，2015，13(8)：959-968.

[4]Bordonaro M，Lazarova D.Hypothesis：obesity is associated with a lower mutation threshold in colon cancer[J].J Cancer，2015，6(9)：825-831.

[5]马丹丹，张智勇，蔡逊.96序列相似的家庭成员B功能的研究进展[J].医学综述，2015，21(5)：791-793.

[6]Yang W，Itoh F，Ohya H，et al.Interference of E2-2-mediated effect in endothelial cells by FAM96B through its limited expression of E2-2[J].Cancer Sci，2011，102(10)：1808-1814.

[7]Ito S，Tan L J，Andoh D，et al.MMXD，a TFIIH-independent XPD-MMS19 protein complex involved in chromosome segregation[J].Mol Cell，2010，39(4)：632-640.

[8]张智勇，蔡逊，马丹丹.96序列相似的家庭成员B在肝癌中的表达变化及功能研究[J].中华实验外科杂志，2014，31(7)：1489-1491.

[9]荆霞，熊兴东，岑锦明，等.FAM96B基因rs3890213-A>G多态性与冠心病的关系[J].广东医学，2013，34(3)：368-370.

[10]Tanaka A，Itoh F，Nishiyama K，et al.Inhibition of endothelial cell activation by bHLH protein E2-2 and its impairment of angiogenesis[J].Blood，2010，115(20)：4138-4147.

[11]翟保平，李文涛，张斌，等.人类DCC基因克隆及真核表达载体构建与鉴定[J].中华实验外科杂志，2011，28(2)：226-228.

[12]Pedersen R T，Kruse T，Nilsson J，et al.TopBP1 is required at mitosis to reduce transmission of DNA damage to G1 daughter cells[J].J Cell Biol，2015，210(4)：565-582.

[13]Janssen A，Kops G J，Medema R H.Elevating thefrequency of chromosome mis-segregation as a strategy to kill tumor cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(45)：19108-19113.

(2015-09-14收稿)

Down-expression of FAM96B in Colon Cancer Tissues and the Effects of FAM96B Overexpression on the Inhibition of the Growth of Colon Cancer Cells and the Apoptosis Inducement

Cai Xun1，Ma Dandan1△，Tian Jun2etal

1DepartmentofGeneralSurgery，WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand，Wuhan430070，China2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，SchoolofBasicMedicine，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo investigate the expression of family with sequence similarity 96，member B(FAM96B)in 56 cases of colon cancer tissues and the effect of FAM96B overexpression on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT-116 cells.MethodsReal-time PCR and Western blot were conducted to quantify the FAM96B mRNA and protein expression levels in tumor tissues and adjacent non-tumor tissues from 56 patients with colon cancer.Moreover，the recombinant plasmid of pcDNA3.1-myc-FAM96B containing the whole sequence of the human FAM96B gene was constructed and transfected into HCT-116 cells.MTT assay was used to evaluate the proliferation of transfected cells，and the cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry.ResultsBoth FAM96B mRNA and protein levels were significantly decreased in tumor tissues as compared with those in adjacent non-tumor tissues in the 56 cases of colon cancer(P<0.05).The MTT assay showed that the A value in FAM96B overexpression group was much lower than in control group(P<0.05)，indicating that overexpression of FAM96B could inhibit the proliferation of HCT-116 cells(P<0.05).FACS analysis revealed that the cell apoptosis rate was significantly increased in FAM96B overexpression group compared to the control group[(44.70±1.12)% vs.(4.30±0.91)%，P<0.05].Additionally，cell cycle analysis by flow cytometry revealed a significant decrease in the cell proportion in G1 phase[(51.58±0.97)% vs.(62.64±0.87)%，P<0.05]and a significant increase in the cell proportion in S phase in FAM96B overexpression group as compared with control group[(35.35±0.58)% vs.(25.79±0.74)%，P<0.05].ConclusionFAM96B was down-expressed in colon cancer tissues.Overexpression of FAM96B could inhibit the proliferation and induce the apoptosis of HCT-116 cells.It is suggested that FAM96B may become a new therapeutic target of colon cancer，as a potential anti-oncogene involved in the occurrence and development of colon cancer.

Key wordsfamily with sequence similarity 96，member B(FAM96B)；colon cancer；cell proliferation；cell apoptosis

中图分类号：R735.35

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.003

通讯作者△，Corresponding author, E-mail：tjmadandan@163.com

*国家自然科学基金资助项目(No.81350006)；湖北省自然科学基金资助项目(No.2012FFB06805)

蔡逊，男，1963年生，主任医师，医学博士， E-mail：caiwenqian@sina.com