FAT/CD36对棕榈酸抑制神经细胞促食欲肽表达的影响*

马　炎，　王萧怡，　张　旭，　杨年红

华中科技大学同济医学院公共卫生学院营养与食品卫生系，教育部环境与健康重点实验室，食品营养与安全湖北省重点实验室，武汉　430030



论著

FAT/CD36对棕榈酸抑制神经细胞促食欲肽表达的影响*

马炎，王萧怡，张旭，杨年红△

华中科技大学同济医学院公共卫生学院营养与食品卫生系，教育部环境与健康重点实验室，食品营养与安全湖北省重点实验室，武汉430030

摘要：目的分析棕榈酸处理对小鼠神经母细胞瘤细胞(N1E-115)食欲相关肽神经肽Y(NPY)、刺鼠基因相关蛋白(AgRP)基因表达的影响，探讨脂肪酸转位酶(FAT/CD36)在此过程中的作用。方法取对数生长期的细胞用10 μmol/L棕榈酸培养5、10、15、20 min，牛血清白蛋白(BSA)为对照组，提取mRNA，检测细胞NPY和AgRP mRNA的表达。采用10 μmol/L棕榈酸培养20 min，比较加或不加FAT/CD36抑制剂N-油酰基硫代琥珀酰亚胺(SSO)预处理对细胞NPY、AgRP、FAT/CD36 mRNA表达的影响。结果①10 μmol/L棕榈酸处理细胞，NPY、AgRP mRNA的表达随时间逐渐降低，20 min降至最低；②10 μmol/L棕榈酸处理20 min，加入SSO预处理30 min组与未加入SSO组相比，NPY、AgRP mRNA表达降低的幅度明显减小。结论培养的N1E-115神经细胞中加入棕榈酸处理可抑制NPY、AgRP mRNA的表达，而这种抑制作用是通过FAT/CD36途径实现的。

关键词：棕榈酸；FAT/CD36；NPY；AgRP

肥胖的根本原因是能量摄入大于能量消耗，下丘脑是机体能量平衡的调节中枢，对各种营养素、激素信号的正确感知和精确调控是维持能量平衡的关键[1]。下丘脑弓状核神经元可以感知机体的能量供应及消耗状态，接受和整合营养素、激素及神经内分泌等信号，通过增加或减少相应中枢食欲调节肽的释放而产生饱足感和饥饿感，对摄食行为进行调节[2]，NPY和AgRP是重要的促进食欲的中枢神经肽。利用药物或基因敲除手段抑制下丘脑肉碱脂酰转移酶(carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1)活性使长链脂酰辅酶A(long-chain fatty acyl-CoA，LCFA-CoA)浓度显著上升，可导致NPY和AgRP表达明显下降，动物摄食量大幅度减少[3]。FAT/CD36是介导长链脂肪酸(long chain fatty acid，LCFA)转运的重要膜蛋白，其表达水平及转运LCFA进入细胞的能力可影响细胞内LCFA-CoA的浓度。使用FAT/CD36特异性抑制剂SSO可使心肌细胞摄取脂肪酸的速率下降80%[4]，而FAT/CD36过表达可使肌细胞摄取脂肪酸的速率大幅提高[5]。另外动物实验表明，肥胖易感幼鼠用腺病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默下丘脑腹内侧FAT/CD36基因后，体重和身体脂肪比对照组显著增加[6]。本研究旨在通过细胞培养探讨FAT/CD36是否参与脂肪酸对中枢神经细胞食欲相关肽表达的影响。

1材料与方法

1.1材料

N1E-115神经母细胞瘤细胞系(上海拜力生物技术有限公司)；DMEM培养液(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；0.25%胰酶+0.02% EDTA溶液(杭州吉诺生物医药技术有限公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；BSA(低游离脂肪酸，脂肪酸含量<0.005%，美国MP公司)；棕榈酸(palmitic acid，PA，纯度≥99%，美国Sigma公司)；CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8，日本同仁化学研究所)；焦碳酸二乙酯(DEPC，美国Sigma公司)；Trizol(Invitrogen公司)；第一链cDNA合成试剂盒(美国Thermo公司)；荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa生物科技有限公司)；引物(上海英骏生物技术有限公司)；其它试剂均为国产分析纯。Eppendorf低温高速离心机、NANODROP 1000微量紫外分光光度计，ABI HT7900 real-time RT-PCR仪。

1.2细胞培养

N1E-115细胞在DMEM培养液和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2条件下进行培养，培养液中加入100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，1～2 d换液1次。

1.3BSA培养液和脂性培养液的配制

①取1.5 g BSA加入5 mL双蒸水，配制成30% BSA溶液。②称取1.182 g棕榈酸放入250 mL用双蒸水配制的0.01 mol/L NaOH溶液中，70℃水浴下30 min促进充分溶解，配制成20 mmol/L的棕榈酸储存液。③分别取330 mL 30% BSA和10、25、50 μL棕榈酸储存液，在20 mL DMEM培养液中混匀中和，用无菌滤器过滤除菌，制成含有10、25、50 μmol/L棕榈酸的脂性培养液。对照组应用的BSA培养液中不加入棕榈酸，所有干预组的BSA含量均为0.5%，pH值在7.1～7.2之间。

1.4CCK-8实验

收集对数生长期细胞，将细胞接种至96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，边缘孔用无菌PBS填充。37℃、5%CO2条件下进行培养，至细胞单层铺满孔底，弃去含血清的培养液，分别加入不含血清的BSA培养液和含棕榈酸的培养液，每孔100 μL，设5个复孔。37℃、5% CO2条件下分别培养。棕榈酸对N1E-115细胞增殖的影响进行预实验(图1结果未全部显示)：选取棕榈酸浓度分别为10、25、50 μmol/L，处理时间分别为10、20、30 min，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃培养箱内孵育1 h。取上清，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(A)值。同时设置调零孔(培养液、CCK-8)，计算细胞活力。细胞活力(%)=[A(棕榈酸处理)-A(空白)]/[A(调零)-A(空白)]×100%，A(棕榈酸处理)：具有细胞、CCK-8溶液和棕榈酸孔的吸光度值；A(空白)：具有培养液和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度值；A(调零)：具有细胞、CCK-8溶液而没有棕榈酸的孔的吸光度值。

1.5棕榈酸干预

收集对数生长期细胞，将细胞接种至6孔板，待细胞80%～85%融合后，饥饿12 h，分别给予不含血清的BSA培养液和含10 μmol/L棕榈酸的培养液干预5、10、15、20 min。每组实验均设3个复孔，重复3～4次。

1.6FAT/CD36抑制剂SSO处理

将细胞接种至6孔板，待细胞80%～85%融合后，饥饿12 h，分别加入含有或者不含有5 μmol/L SSO的DMSO溶液，37℃培育30 min。PBS冲洗3次，分别给予不含血清的BSA培养液和含10 μmol/L棕榈酸的培养液干预20 min。每组实验均设3个复孔，重复3～4次。所有的干预组DMSO的含量均小于0.05%。

1.7细胞mRNA水平测定

细胞按照上述分组进行培养，待细胞成熟后进行RNA提取及荧光实时定量PCR：按Trizol说明书提取细胞中总RNA，核酸蛋白测定仪测定RNA浓度，逆转录得到cDNA后进行荧光实时定量PCR。目的基因的cDNA序列在GenBank中查出，用Primers5.0软件设计引物，交由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列见表1。SYBR Green PCR扩增程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环后加载溶解曲线。以GAPDH作为参照基因，采用相对标准曲线法计算各基因的相对表达。

表1　GAPDH、FAT/CD36、NPY及AgRP基因的引物序列

1.8统计学方法

2结果

2.1N1E-115细胞生长形态的观察及棕榈酸对N1E-115细胞增殖的影响

通过倒置显微镜观察(图1A)N1E-115细胞在培养及传代过程中的生长情况。镜下，N1E-115细胞为贴壁细胞，培养过程中细胞分布均匀，生长状态良好，排列紧密。N1E-115细胞形态不规则，大小基本一致。经不同浓度棕榈酸处理后，细胞状态良好，细胞集落明显，形态无明显变化，且无明显的细胞碎片。如图1B所示，10 μmol/L棕榈酸分别处理N1E-115细胞10、20 min，与BSA对照组比较，细胞活性差异均无统计学意义。因此上述棕榈酸处理浓度和时间，不会因细胞活性的降低对实验结果产生影响。

A：培养24 h N1E-115细胞(×40)；B：细胞存活率图1　N1E-115细胞形态及10 μmol/L棕榈酸干预后N1E-115细胞的存活率Fig.1 The cell morphology of N1E-115 and the cell viability of N1E-115 treated with 10 μmol/L PA

2.2棕榈酸对NPY、AgRP mRNA表达的时间效应

如图2所示，细胞饥饿12 h(T=0)时，NPY和AgRP基因表达水平最高，加入BSA和含10 μmol/L棕榈酸的培养液均使细胞NPY和AgRP基因表达水平下降，20 min时降至最低。相同时间点的比较发现，棕榈酸组NPY和AgRP mRNA表达在20 min时显著低于BSA组(P<0.05)。

与T=0组比较，*P< 0.05；与相同时间点BSA组比较，#P<0.05图2　10 μmol/L棕榈酸干预N1E-115细胞不同时间NPY、AgRP mRNA的表达Fig.2 Expression of NPY and AgRP mRNA in N1E-115 cells treated with 10 μmol/L PA for different time

2.3棕榈酸对FAT/CD36 mRNA表达的时间效应

FAT/CD36 mRNA的表达在T=0处最低，随着棕榈酸处理时间的延长，20 min时表达量最高(P<0.05)(图3)。

与T=0组比较，*P<0.05；与相同时间点BSA组比较，#P<0.05图3　10 μmol/L棕榈酸干预N1E-115细胞不同时间FAT/CD36 mRNA的表达Fig.3 Expression of FAT/CD36 mRNA in N1E-115 cells treated with 10 μmol/L PA for different time

2.4SSO预处理对FAT/CD36、NPY、AgRP mRNA表达的影响

如图4所示，与未加入SSO的棕榈酸组相比，SSO预处理后FAT/CD36 mRNA的表达明显增加(P<0.05)；NPY和AgRP mRNA表达降低的幅度明显减弱(P<0.05)。

3讨论

下丘脑可接收外周激素和营养素传入信号，与中枢神经系统其他部位的传入信号进行整合，通过传出信号调节摄食行为和能量消耗，促使机体达到能量平衡[7-9]。近年来，越来越多的研究表明神经细胞能够感应脂肪酸，而下丘脑神经细胞对脂肪酸的感应在食欲调控中发挥着重要作用[10-11]。脂肪酸感应失调可以引起能量失衡，最终导致肥胖的发生[12]。下丘脑神经系统调控食欲是一个十分复杂的过程，虽然有研究表明向下丘脑灌注脂肪酸能够降低食欲及减少肝脏葡萄糖的输出[11]，但是在过度喂养的大鼠中下丘脑中枢脂肪酸感知失调，不能正确调节摄食[8]。因此对于下丘脑神经系统调控食欲的具体机制需要进一步研究。

与T=0组比较，*P< 0.05；与20 min 10 μmol/L棕榈酸组比较，#P<0.05图4　SSO预处理后10 μmol/L棕榈酸干预N1E-115细胞20 min FAT/CD36、NPY、AgRP mRNA表达的变化Fig.4 Expression of FAT/CD36，NPY and AgRP mRNA in N1E-115 cells treated with SSO and then with 10 μmol/L PA for 20 min

本实验选取N1E-115细胞作为研究对象，该细胞是一种神经母细胞瘤细胞，可用于研究神经递质及其受体的改变。棕榈酸是人类饮食中最常见的饱和脂肪酸，占人血浆中饱和脂肪酸的65%，总脂肪酸的32%[13]。代谢综合征的患者与正常人相比血清棕榈酸水平明显增加[14]。本研究选取棕榈酸处理神经细胞，通过细胞形态观察和CCK-8实验确定棕榈酸浓度和干预时间，以保证棕榈酸处理不会因细胞活性的改变对实验结果造成干扰。研究发现10 μmol/L棕榈酸干预细胞20 min时，NPY和AgRP显著降低，表明棕榈酸可以抑制该神经细胞NPY/AgRP基因的表达。

FAT/CD36是一种广泛表达于多种组织细胞的单链跨膜糖蛋白，作为一种重要的脂质转运蛋白，在LCFA的转运过程中起到显著的作用[11，15]。之前对于FAT/CD36的研究大部分集中在外周组织中，如：脂肪酸能够促进前体脂肪细胞[16]以及新生的心肌细胞[17]FAT/CD36的表达，高脂喂养的小鼠心肌FAT/CD36的表达较正常小鼠有5倍增长[18]，电刺激能够上调骨骼肌FAT/CD36的表达并且增加脂肪酸的转运[19]。近年来有研究发现FAT/CD36在神经细胞感知脂肪酸，调节摄食方面发挥着重要的作用。Le Foll等[9]通过细胞实验发现油酸刺激对下丘脑神经元的兴奋和抑制作用受FAT/CD36影响最大，且不受细胞内脂肪酸代谢速率的影响。同时动物实验表明，用腺病毒介导shRNA沉默大鼠下丘脑腹中核FAT/CD36基因后，颈动脉注入脂肪乳，可以明显改善单纯脂肪乳灌注引起的摄食降低[12]。本实验中我们发现，加入正常生理浓度的棕榈酸处理神经细胞一定时间，FAT/CD36的表达会逐渐增加，同时NPY/AgRP会逐渐降低。为明确FAT/CD36增高与NPY/AgRP的关系，比较加入和不加入FAT/CD36的抑制剂SSO预处理细胞30 min后，棕榈酸处理对NPY/AgRP表达的影响，结果发现SSO处理可显著减弱棕榈酸对NPY/AgRP表达的抑制作用。在我们的研究中还发现SSO处理FAT/CD36的表达较对照组也有升高，由于SSO的作用是特异性与FAT/CD36结合，导致这种蛋白失去原有的功能，并不会降低其表达量[20]。我们推测FAT/CD36表达增加是由于FAT/CD36功能抑制后的代偿性变化。提示FAT/CD36通过感知脂肪酸浓度，并将脂肪酸转运入细胞使N1E-115神经细胞下调NPY、AgRP mRNA的表达。

由之前的动物实验我们发现，高脂饲料喂养会造成大鼠肥胖，肥胖大鼠下丘脑FAT/CD36的表达明显高于正常大鼠，但是其NPY/AgRP的表达并没有降低，结合细胞实验我们推测肥胖大鼠FAT/CD36感受脂肪酸的功能发生障碍，导致FAT/CD36不能正常调节NPY/AgRP的表达，最终导致肥胖发生。同时最近的研究还发现FAT/CD36介导的LCFA摄取需要富含Cav-1的胞膜窖参与[21]，Cav-1在辅助FAT/CD36转运脂肪酸过程中起到重要作用，有研究表明抑制Cav-1的表达能够降低FAT/CD36转运脂肪酸的作用。因此FAT/CD36影响NPY和AgRP表达的具体机制以及Cav-1与FAT/CD36之间的关系有待进一步深入研究。

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(2016-02-24收稿)

FAT/CD36 Is Involved in the Suppression of the Expression of NPY and AgRP Genes by Palmitic Acid in N1E-115 Cells

Ma Yan，Wang Xiaoyi，Zhang Xuetal

DepartmentofNutritionandFoodHygiene，MOEKeyLabEnvironmentandHealth,HubeiKeyLaboratoryofFoodNutritionandSafety,SchoolofPublicHealth，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo explore the effect of palmitic acid on the gene expression of neusopeptide Y(NPY)and agouti gene-related protein(AgRP)in murine neuroblastoma cell line N1E-115，and to investigate the role of fatty acid translocase(FAT/CD36)in the process.MethodsN1E-115 cells at the logarithmic phase were treated with 10 μmol/L palmitic acid for 5，10，15 and 20 min，with bovine serum albumin(BSA)serving as control.The expression of NPY and AgRP mRNA was detected in the cells.Additionally，the effect of sulfosuccinimidyl-oleate(SSO)，an inhibitor of FAT/CD36，on the expression of NPY，AgRP and FAT/CD36 was examined in N1E-115 cells treated with 10 μmol/L palmitic acid for 20 min.Results①Palmitic acid(10 μmol/L)could significantly decrease the expression of NPY and AgRP mRNA in a time-dependent manner.②The decrease in the expression of NPY and AgRP mRNA was significantly attenuated in cells treated with 10 μmol/L palmitic acid for 20 min and SSO for 30 min.ConclusionPalmitic acid can suppress the expression of NPY and AgRP genes in N1E-115 cells via the fatty acid transport protein FAT/CD36 pathway.

Key wordspalmitic acid；FAT/CD36；NPY；AgRP

中图分类号：R589.2

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.001

*国家自然科学基金资助项目(No.81273052)

马炎，女，1987年生，博士研究生，E-mail：584907965@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：zynh@mails.tjmu.edu.cn