一株鸭源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析

黄 忍肖华平范建华

（1.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261000；2.中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州 225125）



一株鸭源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析

黄 忍1肖华平1范建华2

（1.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261000；2.中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州 225125）

［摘 要］从山东潍坊某发病鸭场分离到1株病毒，经分离、鉴定为鸭新城疫。对该分离病毒进行了毒力和致病性等生物学特性分析。结果，该分离病毒连续传3代后，HA效价稳定在9log2以上，MDT为124.5h，ICPI为0.292，F基因核苷酸和转译氨基酸与传统Lasota株的同源性最高，与Kuwait256株最低。而F基因裂解位点的氨基酸组成与NDV强毒株的特征性结构一致（“112R-R-Q-K-R-F117”）。结论：（1）该病例为鸭Ⅰ型新城疫弱毒株感染；（2）F基因的裂解位点的特征性结构不完全决定鸽新城疫的毒力。

［关键词］鸭新城疫HA效价F基因

鸭新城疫又称鸭副黏病毒病，是由鸭Ⅰ型副黏病毒引起的，目前危害我国养鸭业的一个主要烈性传染病。发病鸭多见于青年鸽，以拉绿色粪便、扭头、翅膀下垂等为主要临床表现。发病率可高至20%以上。急性发病期，如果有其他细菌性疾病和寄生虫病伴发，死亡率还会更高。本实验主要针对山东潍坊地区某规模化鸭场的发病情况，及时采取病死鸽的脑 、脾脏等组织进行了病毒分离和鉴定，以及相关的生物学特性研究，旨在探明该鸭场发病原因，为进一步治疗提供参考和依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验鸡和鸡胚 SPF鸡胚购自山东家禽所，SPF雏鸡在中国动物卫生与流行病学中心孵化、饲养。

1.1.2标准阳性血清 NDV、AIVH5、H9和EDSV标准阳性血清，均购自中国兽药监察所。

1.1.3试验用菌株和质粒 E.coli DH5α和pGEM-T Easy载体均由中国动物卫生与流行病学中心提供。

1.1.4试验用试剂 RNA提取试剂盒、RT-PCR 试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒IPTG、X-gal、RNA 酶抑制剂、EcoR I和DNA Marker DL2000、氨苄西林和DEPC均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2方法

1.2.1病毒分离、噬斑纯化 参照文献［4］方法进行。

1.2.2血清学鉴定 用β-半数微量法测定尿囊液HA效价，用NDV、H5、H9、EDS-76标准阳性血清进行HI试验。

1.2.3病毒毒力测定 MDT和ICPI测定：参照《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》（SN/T111022002）规定的标准方法进行。

1.2.4引物设计、合成和基因测序 根据GenBank上已发表的NDV F基因全基因序列，利用primer 5.0软件自行设计了引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列为：P1：5′-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3′，P2：5′-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3′，扩增产物经常规方法连接、转化、鉴定后测序。

1.2.5同源性比较和进化树分析 利用MEGA4.0软件对所测序列和GenBank上已公布的NDV毒株序列进行比较，根据F基因ORF 1-389nt之间的核苷酸序列构建进化树和基因分型，并分析裂解位点的氨基酸组成。

2　结果

2.1病毒分离、纯化结果

病毒接种SPF鸡胚，48 h以后全部出现死亡，死亡鸡胚胚体均表现弥漫性出血，尤以胚的头部、肝脏和肾脏出血严重；病毒前2代细胞噬斑出现时间、大小不一，到第3代以后噬斑出现时间是48 h以内，大小较均匀。

2.2血清学鉴定结果

病毒连续传至第3代以后，HA效价稳定在9log2以上；HI试验表明，该分离病毒的红细胞凝集性可被NDV抗血清抑制，AIVH5、AIVH9及EDS-76阳性血清表现阴性，初步鉴定为新城疫病毒感染。

2.3病毒毒力测定结果

2.3.1MDT测定结果 取10-6～10-9稀释度分离、纯化的病毒，每个稀释度接种5只10日龄SPF鸡胚，0.1 ml/只，照蛋3次/d，间隔8 h，共观察7 d，记录鸡胚死亡时间，结果（见表1）表明，引起鸡胚死亡的最高稀释度（MLD）在10-7，计算得MDT为124.5h。

表1　SPF 鸡胚接毒后死亡情况

2.3.2ICPI测定结果 取1日龄雏鸡10只，各脑内注射10-1稀释度的纯化尿囊液0.05 ml。另取2只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05 ml。接种后，每天在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常（活动灵活，行动无共济失调现象）、发病（包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡）和死亡。观察8 d（结果见表2），计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值（正常为0、发病为1，死亡为2），累计总分数，计算得ICPI为0.292。

2.4F基因测序结果

经一步法RT-PCR，获得1条约480bp的特异性扩增条带，与预期扩增的目的片段大小相符（见图1）。应用MEGA4.0软件分析测序结果，推导其氨基酸序列，发现该毒株F基因裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117，与NDV强毒株的特征性结构相符。

表2　1日龄SPF鸡脑内接种后发病情况

图1　NDV F 基因的RT-PCR扩增产物

2.5同源性分析结果

应用MEGA4.0软件，将W1株与GenBank中已公布的具有代表性的NDV毒株F基因ORF 1-389nt之间核苷酸进行同源性比较分析，结果见表3。其中，与Lasota株的同源性最高，核苷酸序列同源性达99.9%，转译氨基酸的同源性达100%；与Kuwait 256株的同源性最低，核苷酸序列同源性达80.5%，转译氨基酸的同源性达82.7%。

2.6系统发育进化树

根据F基因ORF的1-389bp序列，应用MEGA4.0软件对GenBank中已公布的NDV毒株与本实验分离毒株的F基因进行序列比对分析，绘制了系统发育进化树（见图2）。本实验分离株在分类地位上属于基因I型。

表3　W1株与已公布的NDV代表株F基因核苷酸和氨基酸的同源性比较（%）

图2　NDV F基因片段（389bp）遗传进化树（注：本实验中的分离株用▲标出）

3　讨论与分析

（1）鸭新城疫是鸭子常见的病毒性疾病之一，主要发病鸭为青年鸭，产蛋种鸭后期也偶有发生。近年来，在我国内陆多个城市的鸭场都有病例报道。本实验研究中的鸭新城疫病毒正是从山东潍坊某规模化种鸭场分离到的。该鸭场有15棚青年鸭，然而自发病以来，发病率和死亡率急剧上升。笔者结合常规血清学方法和分子生物学手段确诊该病例为鸭新城疫弱毒株感染，从分类地位上属于基因型I型，从核苷酸和转译氨基酸组成来看与传统Lasota株的同源性最高，与Kuwait 256株同源性最低，这可能与该分离病毒的始源和传代次数有关。但从MDT和ICPI的测定数据，以及F基因序列特征结构等来看，不能确定为是Lasota疫苗株的变异，这与有关文献报道不一。

（2）自新城疫首次发生以来，有关新城疫的毒力与F基因或HN基因序列特征结构的相关性报道很多，争议也很大。Collins［1］等人从鸽子上分离到一株新城疫病毒，并开展了生物学特性研究，认为新城疫的毒力和致病性与F基因序列特征结构相关，然而Pearson［2］等从鸽分离的10株新城疫病毒进行毒力型测定时，发现这10株鸽分离物至少相当于鸡新城疫中的中发型毒株，但其最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间（MDT）最低值为98h，与鸡的中发型毒株的MDT小于90h又表现出不一致，而且这几株分离物通过泄殖腔、鼻腔或肌肉注射时不使鸡发病；范建华［8］等也发现鸽新城疫的毒力与F基因序列无关。本实验分离到的一株鸭新城疫，经实验室鉴定，MDT〉90h，ICPI 〈0.5，符合弱毒株的特征性结构，而F基因转译氨基酸的组成（112R-R-Q-K-R-F117）又符合强毒株特征。因此，新城疫的毒力和致病性不能完全由新城疫的F基因裂解位点的特征性结构决定。

参考文献

［1］ Collins M S.Strong I.Alexander D J.Pathogenichy and phytegenetie evaluation of the varian Newcastle disease viruses termed“pigeon PMV-l Viruses”based on the nucleofide sequence of the fusion protein gene［J］.Arch Viro1，1996，（14l）：635-647.

［2］ Pearson J E，Senne D A，Alexandex D J，et a1.Characterization of Newcastle disease virus isolated from pigeons ［J］.Avian Dis，1987，（31）：105-111.

［3］ Werner O，Romer-Oberdorfer A，Kollner B，et a1.Characterization of avian paramyxovirus type I strains isolated in Germany during 1982 to 1986［J］.Avian Pathology，1999，（28）：79.

［4］ 殷震，刘景华.动物病毒学（第2版）［M］.北京：科学出版社，1997.

［5］ 孙淑红，崔治中.鸡胚中新城疫强毒的分离、鉴定与生物学特性研究［J］.畜牧兽医学报，2007，38（7）：741-743.

［6］ 刘华雷，蒋小刚，张维，等.一株Class I新城疫病毒中国分离株分子特性的研究［J］.中国动物检疫，2009，25（8）：30-33.

［7］ 孙杰，刁有祥，李建侠，等.10株鸭源新城疫病毒的分离鉴定及F基因遗传进化分析［J］.畜牧兽医学报，2010，41（8）：1054-1060.

［8］ 范建华，刘华雷，刘学贤，徐步，等.一株鸽新城疫病毒的分离鉴定［J］.中国畜牧兽医文摘，2011，27（6）：44-47.