C19、C27多肽对人主动脉平滑肌细胞的趋化活性

宣成睿　沈晨阳

(内蒙古医科大学病理生理教研室，内蒙古　呼和浩特　010059)



·经验交流·

C19、C27多肽对人主动脉平滑肌细胞的趋化活性

宣成睿沈晨阳1

(内蒙古医科大学病理生理教研室，内蒙古呼和浩特010059)

〔关键词〕趋化素样因子1；血管平滑肌细胞；趋化作用；动脉粥样硬化

趋化因子超家族(CKLFSF)在人类有九个成员，即：趋化素样因子(CKLF)和CKLFSF1～8。该基因家族的基因编码的产物特点为其结构介于经典的趋化因子和四次跨膜蛋白之间。CKLF1具有CC 家族趋化因子的结构特征和基本功能，即连续两个半胱氨酸的特征性结构和趋化功能〔1〕。本研究选择CKLF1 C端的两段多肽——C19、C27多肽，体外观察二者对人主动脉平滑肌细胞的趋化活性。

1材料和方法

1.1主要试剂和材料达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)购自Gibco公司，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，单克隆小鼠抗人平滑肌α-actin抗体(北京中衫金桥生物有限公司)。磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)、枸橼酸钠抗原修复液(pH 6.0，北京鼎国生物技术有限责任公司)。苏木素、伊红、分化液、返蓝液(北京天合力恩化学试剂公司)。C19,C27多肽由北京大学医学部免疫实验室韩文玲教授惠赠，Transwell(Costar公司)。

1.2细胞培养动脉血管的取材来自肝移植手术供体的髂动脉.采用组织贴块法培养动脉平滑肌细胞。细胞培养：在无菌的条件下将动脉外膜撕去，用刀片刮除血管内皮细胞，将血管中膜剪成 1.5 mm×1.5 mm 铺置无菌培养瓶底，组织块间距离不超过0.5 cm，瓶底朝上，向培养瓶中加入5～6 ml 含20%FBS体积分数DMEM培养液，置于37℃孵箱，6～8 h后将其缓慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中。当一些组织块周围细胞生长相当密集以致失去特有的梭形形态时，按1∶1或 1∶2进行传代。实验过程中选用3～6代细胞。

1.3细胞鉴定使用倒置相差显微镜观察动脉平滑肌细胞行形态学鉴定,并用α-actin 行免疫组织化学染色鉴定。

1.4实验分组及方法趋化实验在24孔Transwell趋化小室中进行，微孔滤膜为聚碳酸酯膜(PC),孔径为8 μm。小室下层分别加入对照组10%FBS的DMEM培养基，实验组1：10%FBS的DMEM培养基稀释C19，多肽片段的终浓度为10%，实验组2：10%FBS的DMEM培养基稀释C27，多肽片段的终浓度为10%。每组设3个复孔。将培养的动脉平滑肌细胞消化离心，用0.5%牛血清白蛋白DMEM培养液重悬，细胞数调整为2×106/ml，小室上层每孔加入0.1 ml细胞悬液。将小室放入37℃，5%CO2孵箱孵育8 h后取出小室，用棉签擦去未迁移的细胞，PBS冲洗3次。用4%多聚甲醛固定20 min,将小室晾干后行结晶紫染色30 min。取下膜，封片。光镜下观察，随机选取3个高倍视野，计算迁移细胞数。

1.5统计学方法采用SPSS13.0软件进行t及q检验。

2结果

2.1细胞鉴定结果光镜下细胞胞质内出现大量的向细胞两极呈放射状的肌丝，纵向平行排列有密区，α-actin免疫组织化学染色结果显示95%细胞胞质呈棕色染色〔抗平滑肌细胞(SMC)阳性〕，证明培养的为平滑肌细胞且纯度较高。见图1。

图1　α-actin免疫组织化学染色结果(×200)

2.2C19、C27 对人动脉平滑肌细胞趋化实验结果对照组迁移细胞数(9±2),实验组1(C19)迁移细胞数(16±3)，趋化指数是1.8(P<0.05)，实验组2(C27)迁移细胞数(28±4)趋化指数是3.1(P<0.01)。两实验组趋化细胞数目差异显著(P<0.01)。

3讨论

动脉粥样硬化(AS)由脂质、碳水化合物、血液成分的灶状沉积,结缔组织和钙沉积所致的,伴有动脉中膜改变的联合病变。目前认为AS的发生是多种致病因素共同作用的结果，其中包括平滑肌细胞，巨噬细胞及T淋巴细胞的聚集；胶原、弹性纤维、蛋白质多糖等结缔组织基质和平滑肌细胞的增生；脂质的沉积等。作为血管中层唯一细胞成分的平滑肌细胞向内膜的迁移、增殖在AS发生、发展整个过程中都起到至关重要的作用。CKLF1与以往发现的大部分趋化因子在功能上有很大的差异。大部分CC家族趋化因子只对单核细胞和淋巴细胞有趋化活性，对中性粒细胞没有作用，CKLF1可以趋化单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞，是CC趋化因子受体(CCR)4的功能性配体。CKLF1的C 端多肽C19、C27是将果蝇表达系统分泌表达的CKLF Ⅰ蛋白,进行N 端测序得到的两种CKLF1分泌形式,位于CKLF1的C端,命名为C19 、C27 多肽〔2〕。趋化分析显示CKLF1-C19 对人外周血淋巴细胞和单核细胞具有一定的趋化活性;而CKLF1-C27只对单核细胞具有趋化活性;但它们均不能趋化人外周血中性粒细胞〔3〕。此外，王娇莉等〔4〕研究发现，利用化学合成的CKLF1 C端肽C19,C27对CCR4、CCR5转染细胞具有趋化作用,C19 趋化活性较弱。本实验发现多肽片段C19、C27对于人离体平滑肌细胞均有一定旳趋化作用，并且多肽C27的趋化活性强于多肽C19，其原因可能是与CKLF1-C27相比,CKLF1-C19缺少CKLF1-C27的N端8个氨基酸相关〔5〕。至于C19与C27多肽片段之间是否也存在相互作用，需实验进一步证明。

4参考文献

1韩文玲,李莹,马大龙,等.利用抑制性减数杂交(SSH) 研究IL-10抑制表达的新基因〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志,2000；20(2):128-31.

2王应,殷彩花,张颖妹,等.CKLF1C末端肽与多种趋化因子受体相互作用〔C〕.北京：中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议，2006：223-4.

3李婷,张颖妹,钟吉,等.人趋化素样因子1C端活性多肤CKLF1-C19和CKLF1-C27 的功能研究〔C〕.北京：中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议,2006:72.

4王娇莉,沈华浩,王应.趋化素样细胞因子1C端肽C19、C27干预对哮喘小鼠气道炎症、黏液分泌及气道反应性的影响〔C〕.湖州：华东地区第6届中青年呼吸医师论坛暨浙江省第29届呼吸疾病学术年会论文，2007：358-63.

5王应,马大龙.新细胞因子趋化素样因子(CKLF1)的发现与新药开发〔J〕.中国药学杂志,2011；46(4):241-4.

〔2015-02-16修回〕

(编辑安冉冉/杜娟)

〔中图分类号〕R543.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-2002-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.102

通讯作者：沈晨阳(1968-)，男，教授，主要从事血管外科疾病研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30672039)

1北京大学人民医院血管外科

第一作者：宣成睿(1978-)，女，副教授，硕士，主要从事心脑血管疾病的研究。