ABCC2-24C>T基因多态性对中国癫痫患者卡马西平剂量和血药浓度的影响
2016-06-03李银英张涛志
李银英 张涛志
郑州大学第二附属医院 郑州 450014
ABCC2-24C>T基因多态性对中国癫痫患者卡马西平剂量和血药浓度的影响
李银英张涛志
郑州大学第二附属医院郑州450014
【摘要】目的观察ABCC2-24C>T基因多态性对中国汉族癫痫患者卡马西平维持剂量和血药浓度的影响。方法以179例卡马西平单药治疗3月以上的中国汉族癫痫患者为研究对象，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP )方法分析患者的-24C>T多态性；同时应用HPLC法测定卡马西平的稳态血药浓度。结果ABCC2-24C>T 三种基因型卡马西平的维持剂量有显著性差异，CC基因型携带者明显高于TT基因型携带者(P<0.05)。-24C>T变异后血药浓度有增加的趋势，即CC
【关键词】卡马西平；癫痫；ABCC2；单核苷酸多态性
卡马西平(carbamazepine，CBZ)是临床上常用的一线抗癫痫药物，应用广泛。但其治疗窗窄且机体对该药物的反应个体差异大。基因多态性可导致药物疗效产生个体差异，是实现个体化治疗的基础核心要素。目前，公认药物转运体P-gp和MRP2在抗癫痫药物的体内转运中发挥重要作用，能够组成血脑屏障，限制药物或异物通过血脑屏障[1]。已有实验证实，大鼠体内MRP2被抑制后，其脑内卡马西平血药浓度显著增加，而MRP2编码基因ABCC2的多态性亦可影响MRP2的表达和功能[2-3]。近年来的研究发现，ABCC2基因存在众多单核苷酸多态性位点，其中，C-24T(启动子区)在中国人群中的变异频率较高，且与MRP2的转运功能相关[4]。目前，尚未见C-24T多态性对卡马西平血药浓度和疗效相关性的研究报道。本研究探讨ABCC2-24C>T基因多态性对中国癫痫患者卡马西平血药浓度的影响，以期为临床个体化用药提供依据。
1资料与方法
1.1研究对象179例患者均来自2010-11—2014-12郑州大学第二附属医院神经内科门诊，男97例，女82例；平均年龄(32.2±15.7)岁；平均体质量(56.04±11.39)kg；平均病程(3.65±7.31)a。入组标准：经临床医生结合患者的临床表现、脑电图和影像学检查(MRI或CT)确诊为癫痫，并按照1981年国际抗癫痫联盟(International League Against Epilepsy，ILAE)关于发作分类诊断标准确定发作类型；正规、单用抗癫痫药物卡马西平，并使用该剂量维持3个月以上；自愿参加实验并签署知情同意书。排除标准：严重不良反应；药物依从性差；患进行性或退行性全身性疾病或中枢神经系统疾病；患器质性脑病，如脑部肿瘤；服用以下任何药物之一：抗肿瘤药物、细胞毒性药物、类固醇化合物、钙离子拮抗剂、酚噻嗪类药物、抗生素等；有酒精或药物滥用史；严重肝、肾功能不全患者。
1.2方法
1.2.1血样采集：所有患者早上服药前采集外周静脉血2份，每份2 mL，1份检测血药浓度，另1份EDTA抗凝，用于基因组DNA提取。
1.2.2卡马西平血药浓度的测定：血样离心后取上层血浆，采用HPLC法测定卡马西平血药浓度。为消除剂量、体质量对血药浓度的影响，将测定的稳态血药浓度除以患者每日每公斤体质量的药量(血药浓度/体质量剂量)使血药浓度标准化。
1.2.3基因组DNA 提取：应用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根科技有限公司)，根据说明书步骤提取血液基因组DNA，-20℃冰箱保存备用。
1.2.4ABCC2-24C>T多态性分析:该位点多态性的分析采用限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)技术。 PCR扩增反应引物序列：上游引物5′- CTG TTC CAC TTT CTT TGA TGA -3′，下游引物 5′- TCT TGT TGG TGA CCA CCC TAA-3′。PCR反应体系：DNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 聚合酶12.5 μL，上下游引物各加入2 μL(10 pmol)，最后加超纯水至25 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性12 min，然后93 ℃变性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，循环35次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR扩增的目的片段长度为211 bp。PCR产物用限制性内切酶BpiI进行酶切，酶切反应体系：1 μL内切酶BpiI，2 μL 10×Buffer，7 μL PCR产物和10 μL超纯水，置37 ℃水浴4～16 h。
1.2.5琼脂糖凝胶电泳：取7 μL酶切产物加入4%的琼脂糖凝胶负极加样孔，以gene finder为染色剂， 0.5×TBE液为电泳液，在100 V电压下电泳30 min，于凝胶成像系统中观察条带。
1.3统计分析应用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料均采用均数±标准差表示，比较前先进行正态分布和方差齐性检验。2组计量资料间比较采用t检验，3组计量资料间比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD法。以χ2检验检测等位基因和基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1基因型分析采用DNA 限制性片段长度多态性(RFLP)分析基因型，其中，ABCC2 -24C/C基因型样本应该观察到56 bp和155 bp 2个条带；而T/C基因型样本则应该观察到211 bp、56 bp和155 bp 3条带；T/T基因型样本只能观察到211 bp 1个条带。判断基因型的电泳图见图1。此外，通过扩增产物直接测序验证分析方法的可靠性，测序图见图2。
条带L为DNA maker，条带1.2表示T/T基因型，条带3.4表示C/C基因型，条带5.6表示T/C基因型
图1ABCC2-24C>T基因多态性分型结果
图Ⅰ：C/C基因型测序图图Ⅱ：T/C基因型测序图图Ⅲ：T/T基因型测序图
图2ABCC2基因-24C>T多态性位点测序图
2.2等位基因和基因型分布ABCC2-24C>T分型成功的179例，C/C型108例，C/T型65例，T/T型6例，T等位基因的频率为21.5%。经χ2检验，ABCC2-24C>T等位基因和基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)
2.3血药浓度与基因型的关系179例患者卡马西平的平均服药剂量为(551±171)mg/d，平均血药浓度为(5.94±1.61)mg·L-1。校正后的平均标准化浓度为(0.24±0.056) kg/L。血药浓度和维持剂量/体质量(Dose/Weight)无相关性(r=0.583，P>0.05)。
ABCC2-24C>T 三种基因型卡马西平的维持剂量有显著性差异(P<0.05)，TT>CT> CC，且CC基因型携带者明显高于TT基因型携带者(P<0.05)。-24C>T变异后血药浓度有增加的趋势，即CC 表1 ABCC2-24C>T各基因型癫痫患者间卡马西平的维持剂量、血药浓度比较±s) 3讨论 癫痫是一种常见的多病因引起的反复发作性的慢性脑部疾患，在神经科的发病率仅次于脑血管疾病，既是常见病，更是我国目前的重大疾病之一。临床上主要通过规范服用抗癫痫药物控制发作。其中卡马西平是目前使用率最高的抗癫痫药物，可作为首选药物用于多种癫痫发作类型。虽然卡马西平疗效肯定、应用广泛，但其治疗窗窄且血药浓度、疗效存在明显的个体化差异。遗传药理学研究表明，药物代谢酶或转运体编码基因的变异可能是造成药物疗效产生个体差异的原因之一。 国外研究表明，卡马西平为MRP2的转运底物，而MRP2编码基因ABCC2单核苷酸多态性能够影响卡马西平在体内的转运[5-7]。研究显示，ABCC2 c.1249G>A (417V>I)突变能够减少CBZ在细胞膜上的转运，最终导致CBZ中枢神经系统的不良反应发生增多[6]。另一项研究也证实，417I携带者卡马西平的转运能力低于野生型携带者[7]。而ABCC2 c.-24C>T(rs717620) 是近年来发现的在中国人群中变异频率较高的位点。研究表明，ABCC2-24C>T变异后MRP2的转运活性降低，CT或TT型基因携带者依立替康的AUC0-∞略高于野生型基因携带者[8]。最近的研究显示，ABCC2-24C>T能显著增加甲氨喋呤的血药浓度，T 等位基因携带者甲氨喋呤的血药浓度明显高于是CC型基因携带者，甚至引起患者出现毒性反应[9]。本研究显示，-24C>T变异后血药浓度有增加的趋势，即CC 总之，本研究首次在中国汉族癫痫患者中研究了ABCC2-24C>T单核苷酸多态性对卡马西平维持剂量和药物浓度的影响，为卡马西平治疗方案优化和癫痫患者个体化给药提供了有价值的信息。但如其他药物基因组学的研究一样，由于不同研究者入选患者和样本量的不同，研究结果常常不一致，因此本研究需要更大的样本量验证研究结果。 4参考文献 [1]Miller DS，Graeff C，Droulle L，et al.Xenobiotic efflux pumps in isolated fish brain capillaries[J].Am J Physiol，2002，282(1)：R191-198. [2]Potschka，PedrowitznM，Loscher W.P-glycoprotein and multidrug resistance- associated protein are involved in the regulation of extracellular levels of the major antiepileptic drug carbamazepine in brain [J].N euroreport，2001，12(16)：3 557-3 560. [3]Loscher W，Potschka H.Role of multidrug transporters in pharmacoresistance to antiepileptic drugs[J].J Pharmacol Exp Ther，2002，301(1)：7-14. [4]Qu J，Zhou BT，Yin JY，et al.ABCC2 polymorphisms and haplotype are associated with drug resistance in Chinese epileptic patients[J].CNS Neurosci Ther， 2012，18(8)：647-651. [5]Schmidt D，Loscher W.Drug resistance in epilepsy：putative neurobiologic and clinical mechanisms[J].Epilepsia，2005，46(6)：858-877. [6]Kim WJ，Lee JH，Yi J，et al.A nonsynonymous variation in MRP2/ABCC2 is associated with neurological adverse drug reactions of carbamazepine in patients with epilepsy[J].Pharmacogenet Genomics，2010，20(4)：249-256. [7]Puranik YG，Birnbaum AK，Marin SE，et al.Association of carbamazepine major metabolism and transport pathway gene polymorphisms and pharmacokinetics in patients with epilepsy[J].Pharmacogenomics，2013，14(1)：35-45. [8]Zhou Q，Sparreboom A，Tan EH，et al.Pharmacogenetic profiling across the irinotecan pathway in Asian patients with cancer[J].Br J Clin Pharmacol，2005，59(4)：415-424. [9]Liu Y，Yin Y，Sheng Q，et al.Association of ABCC2-24C>T Polymorphism with High-Dose Methotrexate Plasma Concentrations and Toxicities in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia[J].PLoS One，2014，9(1)：e82681. [10]Subenthiran S，Abdullah NR，Joseph JP，et al.Linkage Disequilibrium between Polymorphisms of ABCB1 and ABCC2 to Predict the Treatment Outcome of Malaysians with Complex Partial Seizures on Treatment with Carbamazepine Mono-Therapy at the Kuala Lumpur Hospital[J].PLoS One，2013，8(5)：e64827. [11]Ufer M，Mosyagin I，Muhle H，et al.Non-response to antiepileptic pharmacotherapy is associated with the ABCC2 -24C>T polymorphism in young and adult patients with epilepsy[J].Pharmacogenet Genomics，2009，19(5)：353-362. (收稿 2015-07-14) 【中图分类号】R742.1 【文献标识码】A 【文章编号】1673-5110(2016)08-0075-03
