离心/膜分离组合式双重血浆置换治疗的临床初步应用

王泰娜 徐 斌 邹 华 季大玺 刘志红 龚德华

离心/膜分离组合式双重血浆置换治疗的临床初步应用

王泰娜 徐 斌 邹 华 季大玺 刘志红 龚德华

目的：建立一种离心式与膜式血浆分离技术组合的新型双重血浆置换(DFPP)模式，通过前瞻、非随机对照研究与膜式DFPP比较，观察其临床治疗的有效性、安全性及优势。 方法：入选因抗肾小球基膜(GBM)抗体或抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)介导疾病需行DFPP的患者，分为两组：已有中心静脉导管及可充分抗凝者接受膜式DFPP，其余患者接受组合式DFPP。前者采用血浆分离器MPS07分离血浆，后者采用血细胞分离机分离血浆，两组均经二级血浆成分分离器 EC20W进行再处理。单次治疗处理1.5倍血浆量，每次补充35～45g人血白蛋白。 结果：入选32例患者(男性15例)，膜式DFPP组14例，组合式DFPP组18例。共行DFPP 79次，其中膜式DFPP 27次。膜式及组合式DFPP对IgG、IgA、IgM的下降率无差别；白蛋白补充量及治疗后血清白蛋白的下降率亦无明显差别；血小板下降率两者相似(P=0.114)；但膜式DFPP致病抗体的下降率显著低于组合式DFPP[(25.62%±11.67%)vs(36.78%±16.44%)，P=0.043]。膜式DFPP组治疗中血流量显著高于组合式DFPP组(P<0.001)；组合式DFPP低分子肝素使用量明显少于膜式DFPP(P<0.001)；组合式DFPP没有增加分离器凝血、溶血、破膜等不良反应。 结论：离心/膜分离组合式DFPP除明显技术优势包括血流量要求低、抗凝需求低外，还具有更好的致病性抗体清除效果，其对血小板的影响与传统DFPP并无差别，不良反应发生率低，具有较好的应用前景。

致病抗体 血细胞分离机 双重血浆置换 血细胞 不良反应

目前双重血浆置换(DFPP)均采用膜式血浆分离技术，实际上是通过空心纤维滤器进行血浆滤过[1-4]，但是空心纤维滤器中存在明显的血液浓缩现象，要求一定的跨膜压(TMP)[5]，膜式血浆分离的技术特点决定了其在临床应用中可能存在困难，如高血流量需行中心静脉置管才能满足治疗需要，而导管的可能带来一系列相关并发症[2,6]；由于血浆分离器相对脆弱，增加了溶血的发生[7-8]；一些接受DFPP患者由于本身存在活动性出血或其他因素导致全身抗凝禁忌(如咯血，DFPP导致凝血因子缺乏及低凝状态，肾穿刺前后)而无法充分抗凝。

另一种血浆分离技术是离心式血浆分离：利用血液中血细胞与血浆成分比重的差异，通过离心使之分层并分离血浆。这种技术分离血浆充分，血流量要求低，凝血风险降低，对抗凝需求小，枸橼酸体外循环抗凝(ACD-A液)即可满足，另外离心式血浆分离避免了破膜、溶血等技术并发症。

但是，目前离心式分离技术还仅用于血细胞分离及血浆置换(PE)等相对简单的治疗模式，复杂性治疗模式如DFPP中应用离心式分离技术国际上还未见相关报道。显然，DFPP如能采用离心方法先进行血浆分离，再利用成分血浆分离器对血浆白蛋白及小分子血浆成分进行再分离及回收，将可很大程度避免上述膜式DFPP存在的问题，使之能更好地应用于临床。

因此，本研究通过前瞻性、非随机对照研究，临床验证离心/膜分离组合式新型双重血浆置换的可行性、有效性、安全性及优势，为此项新技术今后临床应用提供依据。

对象和方法

研究对象 2013年9月至2014年12月期间因致病抗体[抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)或抗肾小球基膜(GBM)抗体]所致疾病在南京军区南京总医院血液净化中心行DFPP治疗的患者，所有患者均签署知情同意书。

排除标准 年龄<18岁；难以纠正的低血压；活动性感染、免疫缺陷合并乙型或丙型病毒性肝炎；严重心脑血管疾病或存在其他不适宜行DFPP的情况。

分组方法 患者入选后分为两组，一组采用传统膜式DFPP治疗(膜式组)，一组采用离心/膜分离组合式DFPP治疗(组合组)，分组标准为：可充分抗凝且已有中心静脉导管的患者分至膜式DFPP组，不能充分抗凝或DFPP前无中心静脉导管的患者分配至组合式DFPP组。

DFPP方法

膜式DFPP[9]所有患者均采用中心静脉留置双腔导管，DFPP采用血液净化装置IQ21(Ltd，日本)，血浆分离器MPS07(面积0.68m2,最大孔径0.5 μm)作一级滤器，血浆成分分离器EC20W(面积2.0m2,孔径0.01 μm)作二级滤器，体外循环连接示意图见图1，使用低分子肝素抗凝，使活化凝血时间延长1倍以上。具体步骤如下:(1)治疗开始时，全血以100～120 ml/min的速度流经一级滤器，滤过血浆以20～30 ml/min速度进入二级滤器再次滤过，第二次滤出液回输至体内，被截留的血浆成分以60 ml/min速度在二级滤器中不断再循环；(2)当二级滤器前压力逐步升至150～160 mmHg时，停止分离血浆，采用生理盐水800 ml冲洗二级滤器，使二级滤器中滞留血浆成分进一步滤过回输体内；(3)最后二级滤器中仍残留的血浆成分弃之。这一过程即为一个循环，结束后继续分离及处理血浆，开始下一循环，直至处理血浆达1.5倍血浆容量时即结束治疗。整个过程中共补充人体白蛋白35～45g(图1)。

图1 膜式双重血浆置换示意图

离心/膜分离组合式DFPP 血管通路为外周密闭式静脉留置针或中心静脉留置双腔导管，采用双针、连续性Spectra血细胞分离机(Gambro BCT,Inc.美国)进行血浆分离，百特BM11单泵进行血浆再循环，抗凝剂为ACD-A液或联合小剂量低分子肝素(ACD-A液与血液的输入速度比为1∶ 15～20)，分离机转速2 000～2 400 r/min，血流量30～50 ml/min，血浆分离速度20～30 ml/min，被截留的血浆成分滞留在二级滤器中不断再循环，再循环流量为60 ml/min。具体步骤同膜式DFPP，联接示意图及治疗实景见图2、3。

图2 离心/膜分离组合式双重血浆置换示意图

图3 离心/膜分离组合式双重血浆置换实景图

检测项目及方法

标本采集 患者首次DFPP时在治疗前、治疗开始30 min及治疗结束后5 min内，留取血液、分离血浆及废浆送检，检测项目包括血浆蛋白，免疫球蛋白IgA、IgG、IgM，血常规及自身抗体ANCA及抗GBM抗体。

实验室检测 血清抗GBM抗体和ANCA(抗MPO抗体和抗PR3抗体)分别采用相应的酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测。

计算公式 血浆容量(PV)=血容量(BV)×[1-HCT]；

(公式1)

BV(男)=0.366 9×(H)3+0.032 9×W+0.604 1

BV(女)=0.356 1×(H)3+0.330 8×W+0.183 3

H为身高(m)，W为体重(kg),HCT为红细胞比容。

单次治疗下降百分率=(1-治疗后浓度/治疗前浓度)×100%

(公式2)

统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行数据统计，正态分布计数资料采用均数±标准差表示，偏态资料采用中位数(四分位间距)表示。两组间比较采用两独立样本均数的t检验，治疗前后比较选用配对t检验，计量资料以构成比表示，组间比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结 果

患者基线特征 共纳入32例患者，其中男性15例，平均年龄49.13±14.30岁。ANCA相关血管炎患者21例，抗GBM抗体介导疾病患者11例，治疗前平均血清肌酐(SCr)(507.4±238.7) μmol/L，合并肾外损害5例(咯血3例，反复发热1例，关节痛1例)。患者进入膜式DFPP组14例，组合式DFPP组18例，共行DFPP 79次，其中膜式DFPP 27次，治疗过程顺利，无一例患者出现治疗相关的严重不良反应。两组患者基线比较除年龄及血小板计数差别明显外，余均无差别(表1)。

表1 两组患者一般资料

DFPP：双重血浆置换；GBM：肾小球基膜；ANCA：抗中性粒细胞胞质抗体

两组DFPP技术参数比较 两组DFPP治疗中的技术参数设置见表2。组合式DFPP组有5例患者采用外周静脉直接穿刺建立血管通路，而膜式DFPP组则均使用中心静脉导管；组合式DFPP组血流量及抗凝剂用量远低于膜式DFPP组，组合式DFPP组有出血倾向的4例患者单用ACD-A液抗凝，且无凝血事件发生。

表2 两组患者双重血浆置换(DFPP)技术参数比较

两种DFPP方式治疗效果的比较

单次治疗血浆白蛋白下降率 两种DFPP模式治疗前后体重变化无差异(P=0.166)，在白蛋白补充无差异的情况下，治疗前后白蛋白无显著变化(P=0.1)，白蛋白下降率及免疫球蛋白下降率亦无差别 (表3)。

单次治疗对致病抗体影响 组合式DFPP组致病抗体下降率为(36.78%±16.44%)，显著高于膜式DFPP组(25.62%±11.67%) (P=0.04)；统计两种模式分别对ANCA及抗GBM抗体的下降率，虽然无明显统计学差异，但组合式DFPP下降率均高于膜式DFPP(表3)。

两种DFPP模式对血细胞的影响 组合式DFPP治疗后血小板下降率与膜式DFPP无差异，红细胞及血红蛋白变化两组亦无差别(P>0.05)，但是治疗前后膜式DFPP白细胞变化率远远大于组合式DFPP；两种治疗方式治疗前后红细胞计数及血红蛋白水平均无差别(表4)。

表3 两种DFPP模式对血浆蛋白水平的影响

#与治疗前比较P<0.05；DFPP：双重血浆置换；GBM：肾小球基膜；ANCA：抗中性粒细胞胞质抗体

表4 两种DEPP模式治疗前后血常规变化

DFPP：双重血浆置换；#与治疗前组间比较P<0.05；*组间比较P<0.05

两组DFPP治疗中不良反应发生率比较 在79次DFPP治疗中，组合式DFPP治疗中无溶血、破膜的发生，膜式DFPP溶血/破膜发生率为14.81%；组合式DFPP治疗有1例次因低钙发生四肢抽搐(经处理后好转)，两组患者治疗中均无严重出血事件发生。

讨 论

传统膜式DFPP由于其技术本身的特点及一些高发的并发症，一定程度上限制了其在临床的推广应用。本文通过前瞻性对照研究，认为采用离心/膜分离技术组合新型DFPP治疗模式在临床是可行的，且较传统膜式DFPP具有一些技术优势。

组合式DFPP的技术优势及临床意义 采用离心式血浆分离方式可最大限度将血浆与血细胞分开从而获得更高的血浆流量，低血流量要求可避免不必要的中心静脉导管留置，本文组合式DFPP组中5例患者采用外周静脉直接穿刺而未采取留置中心静脉导管。避免导管相关并发症如穿刺损伤、血管血栓栓塞及狭窄、导管相关感染等[2,10-14]。低血流量也使体外循环压力明显降低，这对于一些特殊情况下的DFPP治疗有益，本单位曾报道一例法乐氏四联症导致严重红细胞增多患者采用膜式血浆分离由于溶血、破膜导致治疗无法进行，最终采用离心式血浆分离而顺利完成治疗的病例[15]。

组合式DFPP对系统性抗凝的需求也明显降低，本研究在组合式DFPP组采用ACD-A液联合小剂量低分子肝素的方法抗凝，类似我们前期报道连续性肾脏替代治疗中抗凝方法，主要目的是为了进一步减少枸橼酸用量、避免相关并发症如低钙相关症状的发生。

组合式DFPP清除致病性抗体的效率 理论上而言，组合式DFPP与膜式DFPP清除致病性抗体应无明显差异，膜式DFPP致病性抗体的下降率此前报道在处理2倍血浆容量下为(31.1%±14.0%)，本研究处理1.5倍血浆容量时为(25.62%±11.67%)，与此前结果相当。令人惊讶的是组合式DFPP致病性抗体下降率明显高于膜式DFPP。组合式DFPP优于膜式DFPP的具体原因尚不明确，其中一个可能原因为在离心力作用下，相同密度物质更易聚集在一起，因此自身抗体聚集后形成分子量更大的多聚体从而更易被二级血浆成分分离器截留而清除。

组合式DFPP对血细胞的影响 采用离心式血浆分离人们所担心的是对血小板的影响。由于血细胞中血小板密度相对较小，难于沉淀，易悬浮于血浆层而被清除。既往有研究认为血浆和血细胞之间的分离是不彻底的[16-17]。在McCullough等[18]的研究中，治疗后血小板下降33%，而膜式血浆置换后血小板下降15%。在本研究中，结果显示组合式DFPP治疗后血小板下降率为17%，略高于膜式DFPP组(9.05%)，但差异不显著。值得注意的是，膜式DFPP组治疗后白细胞计数明显升高， DFPP治疗后白细胞计数水平的升高是否与分离器膜材料对其的激活效应不得而知[19]，但组合式DFPP组对其影响小对患者更有利。

小结:将离心及膜分离技术组合建新型DFPP模式临床可行，具有明显技术优势，包括血流量要求低、系统性抗凝需求低、技术并发症少，且具有与膜式DFPP相当的免疫球蛋白清除效率，但对致病性抗体的清除效应更高，对白细胞水平影响更小，同时不良反应少，具有在临床进一步推广应用的价值。然而，本研究尚存在一定不足，本文虽是前瞻性研究，但分组未随机进行，而是根据是否有中心静脉置管及是否能耐受充分抗凝进行分组，因此可能会存在选择偏倚而影响研究结果；同时本研究更多从技术层面及短期临床效应来比较两种方式的不同以证实组合式DFPP的优势，今后还需从临床角度来分析两者对改善患者总体预后及肾脏预后是否存在差异。我们发现组合式DFPP清除致病性抗体效率高于膜式DFPP，但还需更多研究来对产生这一现象的机制进行阐述。

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(本文编辑 律 舟)

Preliminary clinical application of centrifuge/membrane hybrid double filtration plasmapheresis

WANGTaina,XUBin,ZOUHua,JIDaxi,LIUZhihong，GONGDehua

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China

Correspondingauthor:GONGDehua(E-mail:gong_doctor@126.com)

T Objective：To establish a new mode of double filtration plasmapheresis (DFPP) combining centrifugal/membranous plasma separation techniques, and to evaluate its efficacy, safety and advantages compared with the traditional membranous DFPP (M-DFPP) through a prospective, nonrandomized controlled study. Methodology：Patients requiring DFPP treatment were screened for enrollment. They received DFPP due to renal diseases associated with anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) or anti-glomerular basement membrane (GBM) antibody. After enrollment, patients who already had central venous catheter and had no contraindications for adequate systemic anticoagulant were assigned to receive M-DFPP, and the others were assigned to receive centrifuge/membrane hybrid DFPP (C/M-hybrid DFPP). For M-DFPP, plasma was separated by a plasma separator MPS07, and passed through a fractional plasma separator EC20W for a second filtration; while for C/M-hybrid DFPP, plasma was separated by a centrifugal apheresis system and was secondly filtrated through a EC20W filter, which was the same as in M-DFPP. For one session of DFPP, up to 1.5 fold of the total plasma volume was processed, with a supplement of 35～45g human albumin. Results：32 patients (15 males) were divided into 14 in M-DFPP and 18 in C/M-hybrid DFPP. A total of 79 sessions of DFPP were performed, with 27 sessions of M-DFPP and 52 sessions of C/M-hybrid DFPP. There was no significant difference between M-DFPP and C/M-hybrid DFPP in the regards of reduction ratio of IgG，IgA, IgM, as well as the amount of supplemented human albumin, reduction ratio of serum albumin and platelets counts [(9.05%±11.89%)vs(17.00%±14.91%)，P=0.114]. While for the reduction ratio of the titer of autoimmune antibodies, C/M-hybrid DFPP was higher than M-DFPP[(36.78%±16.44%)vs. 25.62%±11.67%),P=0.043]. The blood flow rate in M-DFPP was significantly higher than that in C/M-hybrid DFPP [(118.21±8.68) ml/minvs. (35.29±4.14) ml/min,P<0.001]. The dosage of LMWH in C/M-hybrid DFPP was much lower than that in M-DFPP. C/M-hybrid DFPP did not increase the incidence of adverse reactions. Conclusion：Compared with M-DFPP, C/M-hybrid DFPP had not only some apparent technical superiorities including lower requirements of blood flow rate and systemic anticoagulation, but also higher efficacy for removal of pathogenic autoimmune antibodies. Besides to these, its effect on platelet count was similar with M-DFPP, and avoided the technical complications associated with M-DFPP like hemolysis.

autoimmune antibody blood cell separator double filtration plasmapheresis blood cell side effect

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.05.007

国家自然科学基金(81170708)

南京大学医学院附属金陵医院(南京军区南京总医院)硕士研究生(王泰娜)，国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)

龚德华(E-mail:gong_doctor@126.com)

2015-10-08

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