奥沙利铂不同浓度和时间对诱导大肠癌细胞系SW480耐药效果的影响

李彩丽，徐倩倩，孙泽群，卢光新

湖北医药学院附属十堰市人民医院食管肿瘤研究所，湖北 十堰 442000

论著·大肠癌

奥沙利铂不同浓度和时间对诱导大肠癌细胞系SW480耐药效果的影响

李彩丽，徐倩倩，孙泽群，卢光新

湖北医药学院附属十堰市人民医院食管肿瘤研究所，湖北 十堰 442000

目的 采取两种方式体外诱导大肠癌耐奥沙利铂耐药细胞系，比较其耐药机制。方法 分别采用低浓度长时间诱导法和高浓度短时间诱导法诱导大肠癌细胞系SW480，建立大肠癌奥沙利铂(Oxaliplatin,OXP)耐药细胞系SW480/OXP1和SW480/OXP2。CCK8法检测SW480、SW480/OXP1和SW480/OXP2耐药指数，绘制细胞生长曲线，检测细胞周期分布；罗丹明123检测细胞膜泵功能，Western blotting检测P-gp和E-cadherin水平。结果 SW480/OXP1对OXP、5-氟尿、顺铂耐药指数分别为10.34±0.35、3.32±0.52、2.76±0.26，SW480/OXP2对OXP、5-氟尿、顺铂耐药指数分别为7.89±0.62、2.78±0.37、2.1±0.23；SW480、SW480/OXP1和SW480/OXP2的群体倍增时间分别为30.50 h、36.64 h和35.87 h。SW480/OXP1和SW480/OXP2的G0/G1比率较亲本细胞上升，而S期比率较亲本细胞下降；正常SW480的罗丹明123排出明显缓于SW480/OXP1和SW480/OXP2。SW480/OXP1和SW480/OXP2的P-gp表达较SW480升高，且SW480/OXP1高于SW480/OXP2。SW480/OXP1和SW480/OXP2的E-cadherin表达均低于SW480，且SW480/OXP2低于SW480/OXP1。结论 OXP低浓度长时间诱导法和高浓度短时间诱导法都可使SW480产生多药耐药性，但是它们的特性仍有部分差异，应按照需要选择合适的诱导方式。

大肠癌；耐药；奥沙利铂

大肠癌是目前主要的致死性肿瘤之一，化疗是目前临床治疗大肠癌的重要手段，尽管逐渐有新型化疗药物问世，但是化疗药物耐药是大肠癌化疗中不可回避的问题，建立耐药细胞系是研究耐药的产生、预防和逆转耐药的重要研究模型。我们采取奥沙利铂体外诱导的方法，分别采取奥沙利铂(Oxaliplatin,OXP)低浓度长时间接触和高浓度短时间接触的方式，建立了2株大肠癌耐药细胞，现将具体情况总结如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 OXP购于江苏恒瑞药业，CCK8试剂盒购于日本同仁化学研究所，碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)和罗丹明123购于美国Sigma公司，抗P-gp抗体购于德国Merck公司，抗E-cadherin抗体购于Bioworld Technology公司。

1.2 细胞系与细胞培养 人结直肠癌SW480细胞系保存于本研究所细胞中心。细胞在含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中贴壁生长，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3 耐药细胞系的建立 按照公式计算OXP峰值血浆浓度(peak plasma concentration,PPC)为4.5 μg/ml [PPC(μg/ml)=50×D×2×103/500，其中D指的是临床应用剂量(mg·kg-1·d-1)][1]。分别采取低浓度长时间诱导方式和高浓度短时间诱导方式诱导SW480对OXP耐药。

1.3.1 低浓度长时间诱导法：SW480细胞贴壁后，换用含0.1×PPC浓度OXP的完全培养基，使OXP与SW480细胞持续接触24 h后，弃培养液，换用不含OXP的完全培养基，待其恢复生长后，再次换用含0.1×PPC浓度OXP的培养液，24 h后撤药换用完全培养基，待其恢复生长后换用含有0.125×PPC的OXP培养基，并重复1次。如此反复换液、传代，以1.25～1.5倍的梯度逐步提高OXP浓度，直至其能耐受1×PPC浓度的OXP，将其维持培养在含1 μg/ml OXP的培养基中，常规冻存，命名为SW480/OXP1。

1.3.2 高浓度短时间诱导法：SW480细胞贴壁后，在培养液中加入OXP，使其终浓度为1 PPC，继续培养2 h，换用无药完全培养基，待存活克隆出现并恢复生长后，重复1次，使OXP终浓度为2 PPC，培养2 h，换用无药完全培养基，并逐渐提高OXP终浓度为4 PPC、6 PPC、8 PPC及10 PPC，并在10 PPC的浓度重复诱导数次，直至10 PPC的OXP作用2 h后对其生长无明显影响，将其维持培养在含1 μg/ml OXP的培养基中，常规冻存，命名为SW480/OXP2。

1.4 CCK8法检测耐药性 取对数生长期的SW480细胞及SW480/OXP1、SW480/OXP2细胞，常规消化，制成1×105/ml细胞悬液，在96孔板中接种90 μl的细胞悬液，培养过夜，配制含OXP、5-氟尿(5-FU)、顺铂(Cisplatin,CDDP) 的培养液，并按照各种药物的PPC(OXP：4.5 μg/ml，5-FU：10 μg/ml，CDDP：3.0 μg/ml)稀释成不同的浓度梯度(0.01 PPC、0.1 PPC、1 PPC、10 PPC、100 PPC)，用含药的培养液置换孔中的培养液，使每种药物的每种浓度有3个复孔，同时设立无细胞仅有培养基的调零组和未加药物的空白组，培养24 h，弃去孔中培养基，加入含10% CCK-8溶液的培养基100 μl，37 ℃孵育2 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。细胞抑制率(%)=(OD空白孔-OD待测孔)/(OD空白孔-OD调零孔)×100%。实验重复3次，SPSS软件计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory oncentration，IC50)，耐药指数(resistance index,RI)=IC50(耐药细胞)/IC50(亲本细胞)。复苏冻存后8周的SW480/OXP1、SW480/OXP2细胞，常规培养传代，传至第三代时，用上述方法检测其RI。

1.5 绘制细胞生长曲线 取生长状态良好的3种细胞，制备单细胞悬液，每种细胞接种4块6孔板(5×104个/孔)，常规培养。每日取3孔细胞进行计数，并取平均值，连续观察7 d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线，据Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间：Td=Tlg2/lg(Nt/N0)；Td：倍增时间(h)；T：细胞数由N0增至Nt所用时间；Nt：T时间后细胞数；N0：初始细胞数。

1.6 细胞周期测定 收集对数生长期的3种细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞2次。加入预冷70%乙醇，4 ℃固定过夜，离心，PBS洗涤，加入500 μl PI染液(含50 μg/ml PI，100 μg/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，4 ℃避光孵育30 min，上流式机。

1.7 罗丹明123排出实验 制备单细胞悬液，以1×106/ml的浓度接种24孔板，过夜贴壁后进行实验，在孔中加入罗丹明123使其终浓度为200 ng/ml，37 ℃培养箱中培养孵育30 min，洗涤3次，换用正常培养基继续孵育60 min，荧光显微镜下观察。

1.8 Western blotting检测P-gp和E-cadherin水平 收集对数生长期的3种细胞，冰PBS洗2次,加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃离心，取上清；蛋白上样量20 μg，10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电流12～15 mA，湿转120 min，电压70 V；1% BSA室温封闭1 h，加小鼠抗P-gp(1∶100)和兔抗E-cadherin(1∶1 000)，4 ℃过夜，分别以羊抗鼠和羊抗兔二抗(1∶5 000)反应2 h，ECL显色，BIO-RAD凝胶成像系统扫描、分析。

2 结果

2.1 细胞形态及一般状况 SW480/OXP1诱导成功耗时8个月，SW480/OXP2诱导成功耗时6个月。在诱导过程中，加入含有OXP的培养基以及撤药后一段时间内，大部分细胞死亡，存活的细胞出现细胞形态异常：如细胞变大或皱缩，胞内空泡增多，形态不规则等，并且在撤药后一段时间内仍有细胞逐渐死亡，存活的细胞多成集落样生长，并逐渐恢复正常梭状形态。最终诱导成功的耐药细胞与正常SW480细胞形态接近亲本，但略细长。

2.2 耐药性 2种方法诱导的耐药细胞诱导成功后，与亲本细胞同时行CCK8实验，获得其耐药指数如表1所示。其中SW480/OXP1和SW480/OXP2对OXP的RI分别为10.34±0.35和7.89±0.62，SW480/OXP1的RI高于SW480/OXP2，经过冻存后SW480/OXP1对OXP的耐药指数略下降，而SW480/OXP2经冻存后耐药指数下降不明显。同时SW480/OXP1和SW480/OXP2对5-FU和CDDP均产生2～3倍的耐药性，且冻存后耐药性较稳定。

表1 3种细胞的耐药性Tab 1 The resistance indexes of SW480,SW480/OXP1 and SW480/OXP2 ±s)

注：与冻存前同种细胞相比，*P>0.05；与SW480/OXP1相比，@P<0.05。

2.3 细胞生长曲线和细胞群体倍增时间 经观察得到3种细胞的每日细胞数后，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线如图1 所示，经公式计算SW480、SW480/OXP1和SW480/OXP2的群体倍增时间分别为30.50 h、36.64 h和35.87 h。

图1 细胞生长曲线Fig 1 Cell growth curve

2.4 细胞周期变化 SW480/OXP1和SW480/OXP2的G0/G1比率较亲本细胞上升，而S期比率较亲本细胞下降(见表2)。

表2 细胞周期的变化Tab 2 The changes of cell cycle for SW480,SW480/OXP1 and SW480/OXP2 ±s,%)

注：与SW480相比,*P<0.05。

2.5 罗丹明123排出实验 如图2所示，罗丹明123可进入细胞，积聚在核膜和胞浆周围，发出明亮的绿色荧光，孵育60 min后，SW480/OXP1和SW480/OXP2可观察到明显的荧光减弱，而正常SW480的荧光排出明显缓于SW480/OXP1和SW480/OXP2。

2.6 P-gp和E-cadherin蛋白表达 SW480/OXP1和SW480/OXP2的P-gp表达较SW480升高，且SW480/OXP1高于SW480/OXP2。SW480/OXP1和SW480/OXP2的E-cadherin表达均低于SW480，且SW480/OXP2低于SW480/OXP1(见图3)。

3 讨论

耐药细胞系是研究耐药的产生，预防和逆转耐药的重要研究模型。目前OXP是大肠癌化疗的一线药物，为了获得具有稳定耐药性的结肠癌细胞，我们使用具有一定天然耐药性的SW480细胞系[1]为亲本细胞，在此基础上，采取体外诱导的方法进一步诱导其耐药性的产生，并比较取OXP小剂量递增和大剂量间歇给药两种不同的方式对于耐药性产生的关系。最终获得了SW480/OXP1和SW480/OXP2，且均具有一定的多药耐药性。2株耐药细胞经常规冻存后耐药性均较稳定，但SW480/OXP2稳定性更佳。SW480/OXP1和SW480/OXP2的群体倍增时间均高于亲本细胞。细胞的群体倍增时间可反映细胞的生长速度，也影响细胞的汇合，当细胞的自然生长超过群体倍增时间时，可导致细胞的凋亡和坏死，而肿瘤的倍增时间越长，对化疗的敏感性就越差[1]。细胞倍增时间的改变也可能是导致耐药的原因之一。2株耐药细胞还出现了G0/G1期比率上升和S期比率下降的情况。而大部分细胞周期特异性化疗药均作用于S期或M期，OXP也对从S期到G2/M期的过程影响较大[2]，这种周期的改变或许有利于耐药细胞逃避化疗药物毒性。

图2 罗丹明123排出实验(100×)Fig 2 Rhodamine 123 efflux of SW480,SW480/OXP1,and SW480/OXP2 (100×)

注：与SW480相比，*P<0.05；与SW480/OXP1相比，**P<0.05。图3 P-gp和E-cadherin蛋白表达 A：相对表达水平；B：蛋白条带Fig 3 Western blotting assay in P-gp and E-cadherin expression A: relative expression level; B: protein bands

P-糖蛋白(P-gp)是重要的膜泵蛋白，与多数肿瘤细胞耐药有关，罗丹明123是P-gp的作用底物，通过罗丹明123在细胞内残留的情况，可反映细胞膜的泵功能。而诱导的2株耐药细胞的罗丹明123的排出能力高于亲本细胞，P-gp的表达也较亲本细胞上升，其中SW480/OXP1的上升幅度高于SW480/OXP2。这说明所诱导的2株耐药细胞的P-gp的表达及功能均较亲本细胞升高。此外，所诱导的2株耐药细胞的E-cadherin表达均较亲本细胞明显下降，且SW480/OXP2的下降幅度高于SW480/OXP2。E-cadherin下降是上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的重要标志物[3]。即在采取两种方法诱导SW480细胞耐药的过程中均出现了EMT 现象，EMT与P-gp的表达有一定的联系[4]，且这两者的表达受一些多共同的信号通路调节[5]。但是，SW480/OXP1和 SW480/OXP2的P-gp和E-cadherin表达也存在一定的差异性。有研究显示，只有长时间接触化疗药物后才引起P-gp转录增加、蛋白表达[6]。SW480/OXP1为逐渐的小剂量化疗药物接触，药物接触时间相对较长，利于P-gp的诱导，而相对于SW480/OXP2较短的峰值浓度接触，高浓度的药物作用，更容易筛选出肿瘤细胞群体中的干系克隆，而EMT现象与肿瘤干细胞的产生有关，故可能更容易出现E-cadherin的下降,但具体机制尚待进一步研究。

综上，采取OXP低浓度长时间诱导法和高浓度短时间诱导，都可使SW480产生对OXP的耐药，并对5-FU和DDP等均产生一定程度的耐药，耐药细胞均表现为倍增时间延长，G0/G1期延长，对罗丹明123排出加快，P-gp表达增加、E-cadherin表达下降，但是低浓度长时间诱导的细胞的耐药指数和P-gp表达高于高浓度短时间诱导，而其E-cadherin表达减弱程度则低于高浓度短时间诱导。

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(责任编辑：马 军)

Effects of different concentrations and time of Oxaliplatin for induced colorectal cancer cell line SW480 resistance

LI Caili,XU Qianqian,SUN Zequn,LU Guangxin

Institute of Esophageal Tumor,Remin Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China

Objective To induce the Oxaliplatin (OXP) resistant colorectal cancer cell lines by two different methods,and compare their characteristics and analyze the mechanisms. Methods Two resistant cell lines were established: SW480/OXP1 and SW480/OXP2. They were induced from colorectal cancer cell line SW480 by exposing them to OXP with low concentration and long time or high concentration and short time respectively,and gradually increasing dose of OXP. The cell growth curve and the doubling time were determined by cell counting. The chemosensitivities of SW480,SW480/OXP1 and SW480/OXP2 to OXP,Cisplatin,and 5-fluorouracil were tested and IC50was measured by CCK8. The cell cycle was examined by flow cytometry. The function of P-gp was determined by Rhodamine 123,the expressions of P-gp and E-cadherin were determined by Western blotting. Results The resistance indexes to OXP,5-fluorouracil and Cisplatin of SW480/OXP1 were 10.34±0.35,3.32±0.52,2.76±0.26,respectively. The resistance indexes to OXP,5-fluorouracil and Cisplatin of SW480/OXP2 were 2 7.89±0.62,2.78±0.37,2.1±0.23,respectively. The population double time of SW480,SW480/OXP1 and SW480/OXP2 were 30.50 h,36.64 h and 35.87 h. The number of the SW480/OXP1 and SW480/OXP2 cells exhibiting G0/G1phase increased and the S phase decreased than SW480 cells. The fluorescence effluence of Rhodamine 123 for SW480/OXP1 and SW480/OXP2 was faster than SW480. The P-gp expression of SW480/OXP1 and SW480/OXP2 was higher than SW480,and the SW480/OXP1 was higher than SW480/OXP2. The E-cadherin expression of SW480/OXP1 and SW480/OXP2 was lower than SW480,and the SW480/OXP2 was lower than SW480/OXP1.Conclusion The two methods can induce multidrug-resistant colorectal cancer cell lines,but their characteristics are partially different.

Colorectal cancer; Drug-resistance; Oxaliplatin

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.02.005

湖北省教育厅科研计划支持(B20122425)

李彩丽，副教授，硕士，研究方向：消化道疾病基础。E-mail: licailili@163.com

孙泽群，主任医师，博士，研究方向：消化道肿瘤。E-mail: wwwszq@163.com

R735.3+4

A

1006-5709(2016)02-0134-05

2015-05-27