布拉氏酵母菌在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究

任 帅，荆 雷，李 丹，王 研，李异玲

中国医科大学附属第一医院消化内科，辽宁 沈阳 110001

论著·非酒精性脂肪性肝病

布拉氏酵母菌在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究

任 帅，荆 雷，李 丹，王 研，李异玲

中国医科大学附属第一医院消化内科，辽宁 沈阳 110001

目的 探讨布拉氏酵母菌在高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)模型中的作用。方法 36只雄性SD大鼠随机分成4组，每组9只，1组：对照组；2组：高脂饮食组(82.5%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇+0.5%胆酸钠+5%蛋黄粉)；3组：布拉氏酵母菌组；4组：高脂饮食+布拉氏酵母菌组。每组分别于第4周、8周、12周处死3只大鼠，进行血清学检测和肝脏病理分析。结果 第8周时高脂饮食组大鼠体质量明显大于对照组[(413.67±41.02)gvs(297.80±25.31)g，P<0.05]；高脂饮食组大鼠ALT、AST、TC、TG明显高于对照组(P<0.05)；高脂饮食+布拉氏酵母菌组大鼠体质量大于对照组，但小于高脂饮食组，差异有统计学意义(P<0.05)。第12周时高脂饮食组大鼠肝脏指数明显大于对照组[(3.455±0.263)%vs(2.609±0.377)%，P<0.05]；高脂饮食组大鼠ALT、AST、TC、TG明显高于对照组(P<0.05)；高脂饮食+布拉氏酵母菌组大鼠ALT、AST、TC、TG低于高脂饮食组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 布拉氏酵母菌可改善NAFLD大鼠的血清学及肝脏脂肪变性。

非酒精性脂肪性肝病；布拉氏酵母菌；高脂饮食

高脂饮食是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的危险因素之一，伴随高血脂可促进NAFLD的发生，同时，高脂饮食可造成肠道菌群紊乱，从而加重肝脏炎症反应，加剧NAFLD[1]。

肠-肝轴学说认为肠道改变在NAFLD发病过程中起重要作用。这一学说是由研究人员[2]在建立小鼠小肠细菌过量生长(small intestinal bacterial overgrowth，SIBO)模型时发现SIBO小鼠的NAFLD发病率明显高于正常小鼠，对这一现象进行深入研究后发现的。肝和肠有共同胚胎学起源，流经肠道的血液通过血管进入门静脉，并流经肝脏，所以当肠道中菌群发生改变，肠黏膜被破坏，肠道中细菌毒素、抗原等物质可经肠道与肝脏之间的血管系统进入肝脏，从而激活肝脏中的Kuffer细胞等免疫细胞，促进免疫因子的产生及免疫系统的激活，推动二次打击对肝细胞的损伤[3]。

肠道在NAFLD中的作用一方面与肠道的通透性相关，肠黏膜通透性增加导致肠道屏障作用下降，肠道中细菌毒素经门静脉系统进入肝脏，从而导致肝脏纤维化加剧[4]，另一方面与肠道菌群有关，当使用抑菌药改善肠道中菌群平衡时，NAFLD实验动物肝纤维化程度得到明显改善[5]。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物：SPF级健康雄性SD大鼠36只，初始体质量(260±10)g，中国医科大学动物部提供。大鼠饲养环境温度为(20±2)℃，湿度为(50±5)%，实验前一周将大鼠放置于实验环境中，自然昼夜节律周期，自由进食进水。实验主要试剂：亿活(布拉氏酵母菌散)(Biocodex，法国)；10%水合氯醛(中国医科大学动物实验中心)；10%多聚甲醛(中国医科大学基础病理学研究室)；主要仪器：Leica RM2235石蜡切片(Leica，德国)；光学显微镜(Olympus，日本)；Olympus AU600全自动生化分析仪(Olympus，日本)；离心机(上海医用离心机厂，中国)；精密秤(沈阳龙腾电子称量有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠NAFLD模型制备与实验分组：将36只雄性SD大鼠随机分成四组，1组：对照组(给予普通饲料)；2组：高脂饮食组(82.5%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇+0.5%胆酸钠+5%蛋黄粉)；3组：布拉氏酵母菌组(普通饮食，第4周开始使用布拉氏酵母菌灌胃，布拉氏酵母菌散10 mg·kg-1·d-1)；4组：高脂饮食+布拉氏酵母菌组(高脂饮食喂养，第4周开始使用布拉氏酵母菌灌胃)，每组9只，第4周、8周、12周各组均处死3只大鼠。

1.2.2 标本采集：分别于造模第4周、8周、12周后处死大鼠，采集大鼠血清、肝脏标本。大鼠处死前禁食12 h后，10%水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)，称取大鼠体质量。腹主动脉取血5～10 ml，使用非抗凝管收集，血液凝固后，4 ℃放置30 min，3 000 r/min离心15 min，取上层血清低温保存待用。麻醉大鼠，剪开腹膜，取肝脏，用冰生理盐水清洗肝脏，称取肝脏重量，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝脏组织用10%多聚甲醛固定，低温保存。

1.2.3 观察指标与检测方法：观察大鼠食欲、精神、毛发情况。测体质量和肝湿重，计算肝指数(肝湿重/体质量×100%)。使用Olympus AU2700全自动生化分析仪检测血清天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)。肝脏病理HE染色，将经过HE染色的肝脏切片置于镜下观察。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件进行处理，组间比较采用单因素方差分析，统计量为F值，检验水准为0.05。若方差分析有统计学意义则采用LSD法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 随着造模时间的延长，对照组和布拉氏酵母菌组大鼠食欲佳，皮毛光滑，精神状态好。高脂饮食组和高脂饮食+布拉氏酵母菌组大鼠自造模开始至第8周食欲亦佳，皮毛光滑，但在造模第8周后食欲尚可，精神逐渐萎靡，皮毛欠光滑。

2.2 各组大鼠体质量、肝指数水平 第4周时各组大鼠体质量、肝指数水平差异均无统计学意义(P>0.05)；第8周时高脂饮食组大鼠体质量明显大于对照组，高脂饮食+布拉氏酵母菌组大鼠体质量大于对照组，但小于高脂饮食组，差异有统计学意义(P<0.05)。第8周及第12周时高脂饮食组大鼠肝指数均明显大于对照组，且差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3 血清学指标测定 第8周时高脂饮食组大鼠ALT、AST、TC、TG明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。第12周时高脂饮食组大鼠AST、ALT、TC、TG明显高于对照组，高脂饮食+布拉氏酵母菌组大鼠AST、ALT、TC、TG低于高脂饮食组，差异有统计学意义(P<0.05);虽高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

表1 各组大鼠体质量、肝指数水平Tab 1 The weight and liver index of rats in each group ±s)

注：与1组相比，*P<0.05；与2组相比，△P<0.05。

2.4 病理组织学检测 肉眼观察：对照组与布拉氏酵母菌组大鼠肝脏鲜红、边缘锐利、质韧；高脂饮食组第8周、12周肝脏体积明显增大，包膜紧张、边缘较顿、色偏黄、质地略软、切面油腻；与高脂饮食组相比，高脂饮食+布拉氏酵母菌组大鼠肝质变性程度均有不同程度的改善。取肝右叶组织1块，用于HE染色。对照组：第4周、8周及12周时肝细胞索均以肝小叶中央静脉为中心呈放射状排列，汇管区无明显炎性细胞浸润；高脂饮食组：第4周时脂肪变肝细胞占30%，8周时占60%，第12周时占80%；布拉氏酵母菌组：第4周、8周及12周时肝细胞索均以肝小叶中央静脉为中心呈放射状排列，汇管区无明显炎性细胞浸润；高脂饮食+布拉氏酵母菌组：第4周时脂肪变肝细胞占30%，第8周时占30%，第12周时占40%～50%(见图1～4)。

表2 各组大鼠血清学指标±s)Tab 2 Serologocal indicators of rats in each group ±s)

注：与1组相比，*P<0.05；与2组相比，△P<0.05。

图1 对照组大鼠肝脏染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 1 Liver staining in the control group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

图2 高脂饮食组大鼠肝脏染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 2 Liver staining in the high fat diet group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

图3 布拉氏酵母菌组大鼠肝脏染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 3 Liver staining in the Saccharomyces boulardii group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

图4 高脂饮食+布拉氏酵母菌组大鼠肝脏染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 4 Liver staining in the high fat diet+Saccharomyces boulardii group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

3 讨论

NAFLD的发病机制主要包括目前被广泛认可的“二次打击”假说[6]及脂质代谢紊乱。除上述原因外，肠道菌群异常所致肠道毒素吸收增加也在NAFLD的发病中占重要地位。Bäckhed等[7]研究发现，向无菌小鼠肠道内定植正常小鼠的肠道菌群，无菌小鼠在摄食减少的情况下体质量显著增长。Torres等[8]研究发现，对NAFLD模型小鼠给予双歧杆菌干预，小鼠肝损伤程度下降，对相关机制进一步研究显示，双歧杆菌改善肠道菌群从而降低血中脂多糖水平，并改善胰岛素抵抗，从而改善肝纤维化。

布拉氏酵母菌散在上世纪20年代被开发，1961年正式上市，主要用于抗肠道中毒素，如大肠杆菌脂多糖、霍乱毒素，调节肠道菌群平衡[9]。调节肠道菌群是治疗NAFLD的治疗手段之一，目前主要使用抗生素或益生菌等调节肠道菌群[10]。但对于布拉氏酵母菌治疗NAFLD研究较少。

本研究通过复制NAFLD大鼠模型，同时给予布拉氏酵母菌进行治疗干扰。各组大鼠不同时间点体质量、肝指数水平、血清学水平及肝脏病理结果提示：高脂饮食可导致体质量和肝指数明显升高，引起肝脏损伤、血脂升高，同时可导致肝脏脂肪变性。布拉氏酵母菌可改善肝脏损伤、降低血脂水平、肝脏脂肪变性。对照组和布拉氏酵母菌组实验结果与高脂饮食组相比，差异无统计学意义，同时高脂饮食+布拉氏酵母菌组大鼠应用布拉氏酵母菌后状态良好，无不良反应出现，说明亿活(布拉氏酵母菌散)对正常大鼠不存在副作用，具有用药安全的特点。总之，本实验成功证实高脂饮食可以诱导大鼠NAFLD模型，布拉氏酵母菌能够减轻肝损伤，改善肝脏脂肪变性。

综上，高脂饮食诱导大鼠NAFLD模型成功；布拉氏酵母菌可改善大鼠NAFLD的血清学及肝脏脂肪变性。

[1]Nanji AA. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis [J]. Clin Liver Dis,2004,8(3): 559-574,ix.

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[4]Abbas G,Silveira MG,Lindor KD. Hepatic fibrosis and the renin-angiotensin system [J]. Am J Ther,2011,18(6): e202-e208.

[5]Miura K,Kodama Y,Inokuchi S,et al. Toll-like receptor 9 promotes steatohepatitis by induction of interleukin-1beta in mice [J]. Gastroenterology,2010,139(1): 323-334,e7.

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[8]Torres DM,Williams CD,Harrison SA. Features,diagnosis,and treatment of nonalcoholic fatty liver disease [J]. Clin Gastroenterol Hepatol,2012,10(8): 837-858.

[9]Dassanayake AS,Kasturiratne A,Rajindrajith S,et al. Prevalence and risk factors for non-alcoholic fatty liver disease among adults in an urban Sri Lankan population [J]. J Gastroenterol Hepatol,2009,24(7): 1284-1288.

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(责任编辑：王全楚)

Effect of Saccharomyces boulardii in non-alcoholic fatty liver disease

REN Shuai,JING Lei,LI Dan,WANG Yan,LI Yiling

Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China

Objective To explore the role of Saccharomyces boulardii in the non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) rats induced by high fat diet. Methods A totol of 36 male SD rats were randomly divided into 4 groups (control group,high fat diet group,Saccharomyces boulardii group,high fat diet+Saccharomyces boulardii group). Three rats were killed in each group at the 4th,8th,12th weeks,serological detection and liver pathological results were analyzed.Results At the 8th week: weight of rats in high fat diet group was obviously higher than that in the control group [(413.67±41.02)gvs(297.80±25.31)g,P<0.05]; ALT,AST,TC,TG in high fat diet group were obviously higher than those in the control group,there was statistically significant (P<0.05); weight of rats in high fat diet+Saccharomyces boulardii group was higher than that in the control group,but lower than that in the high fat diet group (P<0.05). At the 12th week: liver index in the high fat diet group was obviously higher than that in the control group [(3.455±0.263)%vs(2.609±0.377)%,P<0.05];ALT,AST,TC,TG in high fat diet group were significantly higher than those in the control group (P<0.05); ALT,AST,TC,TG in high fat diet+Saccharomyces boulardii group were higher than those in the control group,but lower than those in the high fat diet group (P<0.05). Conclusion Saccharomyces boulardii can improve the serology and hepatic steatosis in rats with NAFLD.

Non-alcoholic fatty liver disease; Saccharomyces boulardii; High fat diet

辽宁省科技厅基金资助项目(2011225015)；沈阳市科技厅基金资助项目(F13-220-9-61)；留学回国人员科研启动资金资助项目，教外司留([2014]1685号)

任帅，硕士，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基础与临床。E-mail：934663287@qq.com

李异玲,博士，教授，主任医师，硕士生导师，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基础与临床。E-mail：lyl-72@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.006

R575.5

A

1006-5709(2016)04-0382-04

2015-09-25