补肾益智方对老年痴呆症大鼠脑内氨基酸类神经递质含量的影响

2016-06-01侯小梅魏晶晶陈志琼

中成药 2016年5期

关键词：老年痴呆症

侯小梅，魏晶晶，陈志琼

（1.重庆医科大学，重庆400016；2.重庆市永川食品药品检验所，重庆402160；3.广州中医药大学，广东广州510405）

补肾益智方对老年痴呆症大鼠脑内氨基酸类神经递质含量的影响

侯小梅1，2，魏晶晶3，陈志琼1*

（1.重庆医科大学，重庆400016；2.重庆市永川食品药品检验所，重庆402160；3.广州中医药大学，广东广州510405）

摘要：目的研究补肾益智方对老年痴呆症大鼠脑内氨基酸类神经递质含有量的影响。方法采用微透析技术收集透析样品，HPLC-FLU方法检测老年痴呆症大鼠脑内天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）和γ-氨基丁酸（γ-GABA）4种氨基酸类神经递质的含有量。结果补肾益智方能明显降低老年痴呆症大鼠脑内兴奋性氨基酸Asp和Glu的含有量，升高抑制性氨基酸Gly和γ-GABA的含有量。结论补肾益智方能降低兴奋性氨基酸含有量，为其防预及缓解老年痴呆症状提供一定的理论依据。

关键词：补肾益智方；老年痴呆症；氨基酸类神经递质；微透析系统；HPLC-FLU

近年来，老年痴呆症发病率大大增加，已成为严重威胁老年人健康的疾病之一。老年痴呆主要包括阿尔茨海默病（Alzheimer，s disease，AD）和血管性痴呆（vascular dementia，VD）。AD又名早老性痴呆，是一种多源性因素引起的原发性大脑神经退行性病变，多伴有乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AchE）活性降低、氨基酸类神经递质含有量改变，AD患者血浆中兴奋性氨基酸类神经递质有显著增加，这主要是由于兴奋性氨基酸类神经递质的神经毒性损害机制，即过量的兴奋性氨基酸类神经递质会导致神经细胞死亡［1-5］。目前，仍缺乏有效的防治药物和方法，文献报道补肾益智方对D-半乳糖加上鹅膏蕈氨酸（ibotenicacid，IBO）损毁脑Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）的老年性痴呆模型大鼠的学习记忆能力有一定的保护作用［6-7］。本研究在采用D-半乳糖致亚急性衰老作用［6-7］形成脑老化的基础上，再以IBO损毁NBM［8］建立AD大鼠模型，研究补肾益智方对该AD模型大鼠脑内氨基酸类神经递质含有量的影响，探讨补肾益智方的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠50只，雄性，体质量330～350 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK（渝）2014-0025。

1.2 药品与试剂补肾益智方，由蛇床子、枸杞子、女贞子、人参、制首乌提取浓缩，制成1.2 kg/L浓缩液（广东省中医院制剂室，批号20140201）。石杉碱甲片（上海复旦复华药业有限公司，批号130704，规格50 μg）。天门冬氨酸（aspartic acid，Asp）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、甘氨酸（glycine，Gly）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， γ-GABA）、2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol，2-MCE）和鹅膏蕈氨酸（ibotenicacid，IBO）均购于美国Sigma公司，批号分别为53931420、43907190、089K07117、026K07361、112K0119和066K3775；邻苯二甲醛（OPA）购于广州威佳科技有限公司，批号04121209。乙腈为色谱纯（美国Tedia公司）；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

1.3 仪器脑立体定位仪（瑞沃德生命科技有限公司）；微透析系统（瑞典CMA公司）；XP205（瑞士梅特勒公司）；DIONEX P680液相色谱仪（美国戴安公司）；酸度计（瑞士梅特勒公司）；Mill-Q超纯水机（美国密理博公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组、造模与给药 SD雄性大鼠50只，随机分为5组，正常对照组注射生理盐水，模型对照组腹腔注射D-半乳糖［（48 mg/（kg·d）］6周，第7周10％水合氯醛麻醉（3.5 mL/kg，腹腔注射）大鼠后，头部固定于大鼠脑立体定位仪上，于顶骨两侧冠状缝后钻出小孔。位坐标为前卤后0.9 mm，中线外侧2.6 mm，深7.5 mm，每侧用微量注射器分别注人药液1 μL（含IBO 5 μg/L），速率0.2 L/min，留针5 min，并另开小孔，将微透析探针套管植入海马区（前囟后1.6 mm，中线左侧1.2 mm，深度6.5 mm）［9-10］，并利用给药小孔用小螺丝和牙托粉将管套固定，手术后缝合皮肤，48 h内肌注青霉素抗感染，补肾益智方高、中、低剂量组造模均与模型组相同，在手术完48 h后灌胃给予补肾益智方6、3、1.5 g/（kg·d），连续灌胃5周，正常对照组和模型对照组则以等量生理盐水灌胃。

1.4.2 透析液的收集给药第1天以0计数，每隔5 d将探针与微型注射泵相连，微透析系统灌流，以2 μL/min速率开始灌流人工脑脊液（145 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，1.2 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2，pH=7.4），30 min时收集透析液，OPA柱前衍生化后，HPLC-FLU测定Asp、Gly、Glu和γ-GABA含有量。

1.4.3 衍生试剂的配制及衍生化反应 OPA衍生化试剂的配方为20 mg OPA+50 μL 2-MCE +5 mL甲醇+9 mL硼酸缓冲液（0.4 mol/L，pH=9.6）。柱前衍生化反应为20 μL样品（对照品）+25 μL OPA衍生试剂，涡旋混匀15 s，静止反应1 min，进样20 μL（所有操作均避光）［11-13］。

1.4.4 标准贮备液精密称取Asp、Glu、Gly和γ-GABA适量置同一500 mL量瓶中，加人工脑脊液至刻度，超声使其溶解即得到浓度均为40 mmol/L的标准贮备液。

1.4.5 液相色谱条件 Synergi Hydro-RP C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）、C18保护柱（4 mm×2 mm，4 μm）均购于美国菲罗门公司；流动相A为乙酸钠缓冲液（10 mmol/L，冰醋酸调节pH为5.3），B为乙腈，梯度洗脱（0～3 min，15％B；3～15 min，15％～55％B；15～18 min，55％～15％B；18～23 min，15％B）；体积流量1.0 mL/min；柱温30℃；荧光检测器，激发波长（λex）及发射波长（λem）分别为340 nm和455 nm。

1.4.6 数据分析用SPSS 13.0软件分析，组间数据比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），数据用均数±标准差（x±s）表示，p<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性实验精密吸取大鼠空白脑脊液、标准贮备液及样品溶液，按“1.4.3”项下方法处理后在“1.4.5”项色谱条件下进样。由图1可知，Asp、Glu、Gly和γ-GABA保留时间分别为3.61、4.68、10.97、13.42 min，峰形对称良好，样品中其他杂质峰不干扰测定，专属性理想。

1.Asp 2.Glu 3.Gly 4.GABA图1　HPLC色谱图

2.1.2 标准曲线线制备精密吸取“1.4.4”项下标准应用液，依次配成浓度为0.5、1、2、5、10、20、40 μmol/L的标准液，按“1.4.3”项进行处理后在“1.4.5”项色谱条件下进样，以峰面积为纵坐标（Y），Asp、Glu、Gly和γ-GABA浓度为横坐标（X）拟合回归方程。结果见表1。

表1　标准曲线

2.1.3 精密度试验取同一标准品溶液（10 μmol/L），按“1.4.3”方法处理和“1.4.5”条件测定，连续进样6次，得到Asp、Glu、Gly和γ-GABA峰面积RSD分别为1.2％、2.7％、1.9％、2.5％，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验精密吸取同一标准品溶液（10 μmol/L），按“1.4.3”方法处理和“1.4.5”条件测定，分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定，得到Asp、Glu、Gly和γ-GABA峰面积RSD分别为2.1％，1.9％，1.6％和2.8％，表明溶液24 h内稳定性良好。

2.1.5 回收率试验取含有量已知（Asp、Glu、Gly、γ-GABA）的样品溶液3份（各20 μL），分别加入含Asp、Glu、Gly和γ-GABA均为10 μmol/L的标准品溶液5、20、80 μL，配成低、中、高（2、5、8 μmol/L）3个浓度，按“1.4.3”条件处理和“1.4.5”条件测定，每个浓度平行测定6次。结果显示，样品的加标回收率在92.6％～103.7％之间，RSD在1.2％～3.9％之间，符合定量测定的要求。

2.2 药理实验结果

2.2.1 补肾益智方对兴奋性氨基酸神经递质Asp及Glu含有量的影响与空白对照组相比，模型对照组Asp及Glu明显降低（p<0.05）；与模型对照组相比，补肾益智方组Asp及Glu随着给药时间的增加呈降低趋势；随补肾益智方给药剂量加大，时间持续，Asp和Glu水平显著低于模型对照组（p<0.05）。见表2～3。

表2　补肾益智方对大鼠天冬氨酸神经递质含有量的影响（±s，n=10）

注：与模型对照组比较，*p<0.05；与空白对照组比较，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白对照组组别　　剂量/ ［g·（kg·d）-1］Asp/（μmol·L-1）-　 4.48±0.23　 4.50±0.17　 4.39±0.05　 4.51±0.18　 4.42±0.23　 4.47±0.20　 4.42±0.11模型对照组　-　 4.19±0.15※4.12±0.17※4.09±0.14※4.03±0.21※4.01±0.17※3.92±0.22※3.89±0.20※补肾益智方低剂量组　1.5　 4.11±0.08　 4.05±0.19　 3.96±0.22　 3.89±0.09　 3.78±0.08　 3.71±0.24*3.69±0.25*补肾益智方中剂量组　3　4.17±0.17 3.99±0.16 3.85±0.24 3.72±0.13*3.50±0.20*3.47±0.17*3.39±0.06*补肾益智方高剂量组　6　4.19±0.11 3.97±0.24 3.77±0.25*3.65±0.18*3.41±0.12*3.31±0.20*3.19±0.14*

表3　补肾益智方对大鼠谷氨酸神经递质含有量的影响（±s，n=10）

注：与模型对照组比较，*p<0.05；与空白对照组比较，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白对照组组别　　剂量/ ［g·（kg·d）-1］Glu/（μmol·L-1）-　 4.98±0.21　 4.93±0.18　 4.89±0.13　 4.91±0.17　 4.89±0.09　 5.05±0.23　 4.99±0.09模型对照组　-　 4.67±0.10※4.55±0.17※4.56±0.15※4.61±0.14※4.62±0.17※4.69±0.14※4.66±0.13※补肾益智方低剂量组　1.5　 4.69±0.12　 4.55±0.24　 4.49±0.08　 4.46±0.21　 4.37±0.15*4.31±0.20*4.24±0.12*补肾益智方中剂量组　3　4.52±0.22 4.38±0.16 4.32±0.19*4.25±0.24*4.07±0.28*3.98±0.15*3.91±0.16*补肾益智方高剂量组　6　4.59±0.14 4.31±0.21*4.18±0.13*4.09±0.26*3.85±0.23*3.77±0.17*3.72±0.14*

2.2.2 补肾益智方对抑制性氨基酸神经递质Gly和γ-GABA含有量的影响与空白对照组相比，模型对照组Gly及γ-GABA均明显降低（p<0.05）；与模型对照组相比，补肾益智方组Gly及γ-GABA随着给药时间的增加呈上升趋势；随补肾益智方给药剂量加大，时间持续，Gly和γ-GABA水平显著高于模型对照组（p<0.05）。见表4～5。

表4　补肾益智方对大鼠甘氨酸神经递质含有量的影响（±s，n=10）

注：与模型对照组比较，*p<0.05；与空白对照组比较，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白对照组组别　　剂量/ ［g·（kg·d）-1］Gly/（μmol·L-1）-　 5.39±0.09　 5.41±0.14　 5.38±0.27　 5.37±0.20　 5.39±0.14　 5.35±0.33　 5.40±0.27模型对照组　-　 4.35±0.11※4.38±0.17※4.44±0.23※4.51±0.25※4.52±0.10※4.48±0.25※4.47±0.30※补肾益智方低剂量组　1.5　 4.42±0.14　 4.53±0.15　 4.55±0.31　 4.57±0.29　 4.63±0.18　 4.61±0.21　 4.65±0.11补肾益智方中剂量组　3　4.38±0.07　 4.54±0.24　 4.59±0.27　 4.71±0.17　 4.77±0.08*4.85±0.27*4.89±0.21*补肾益智方高剂量组　6　4.44±0.17 4.57±0.22 4.79±0.21*4.91±0.13*5.03±0.25*5.12±0.23*5.24±0.19*

表5　补肾益智方对大鼠γ-氨基丁酸神经递质含有量的影响（±s，n=10）

注：与模型对照组比较，*p<0.05；与空白对照组比较，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白对照组组别　　剂量/ ［g·（kg·d）-1］γ-GABA/（μmol·L-1）-　 6.36±0.13　 6.27±0.17　 6.41±0.25　 6.39±0.27　 6.45±0.23　 6.37±0.17　 6.39±0.25模型对照组　-　 5.34±0.19※5.41±0.25※5.48±0.17※5.50±0.29※5.51±0.27※5.53±0.23※5.54±0.19※补肾益智方低剂量组　1.5　 5.36±0.24　 5.43±0.11　 5.52±0.33　 5.57±0.30　 5.63±0.21　 5.69±0.25　 5.71±0.35补肾益智方中剂量组　3　5.33±0.28　 5.39±0.20　 5.53±0.20　 5.61±0.28　 5.68±0.22　 5.75±0.19　 5.86±0.31*补肾益智方高剂量组　6　5.38±0.23　 5.51±0.18　 5.58±0.29　 5.67±0.26　 5.85±0.26*5.97±0.30*6.08±0.14*

3 讨论

缺乏有效的防治手段是当前AD研究中需要解决的主要问题之一。目前在临床上已经使用的AD治疗药物主要有胆碱酯酶抑制剂、钙通道阻滞剂和神经营养剂等，但疗效均不理想［3-4］。发挥中医用药特色，寻找有效治疗AD的中药具有十分重要的意义。国内外多篇文献提示补肾、调心等方药对实验性AD模型鼠学习记忆能力有一定的改善作用［6，14-15］。中医认为AD等老年痴呆症的主要病机为肾虚髓亏、脑脉失养。补肾益智方由蛇床子、枸杞子、女贞子、人参、制首乌中药组成，是针对AD肾精不足、气血亏虚的病机而设计的组方；全方具补肾填精、益气养血、开窍醒神等功效，临床试用于AD病人已显示了一定的疗效［16］，且实验室前期水迷宫实验表明，补肾益智方能显著提高大鼠学习记忆能力［6，14，17］。

Asp、Glu、Gly和γ-GABA是神经药理中常涉及到的4种最重要的氨基酸类神经递质，其中，Asp、Glu是兴奋性氨基酸，Gly和γ-GABA是抑制性氨基酸。近几年，有关兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸与AD发病及学习记忆的密切关系已引起重视，一般认为兴奋性氨基酸具有神经毒性，兴奋性氨基酸的大量释放可致神经细胞损伤，其机制与Ca2 +超载有关［3，18］，抑制性神经递质具有突触后抑制作用，可通过减少Ca2 +内流而发挥神经保护作用。本实验发现，补肾益智方能显著降低实验性AD大鼠脑积液中兴奋性氨基酸Asp和Glu的含有量，升高抑制性氨基酸Gly和γ-GA-BA的含有量，这可能与其防治AD的机制之一。实验还发现模型组动物脑积液中4种氨基酸含有量都明显低于空白对照组，这可能是由于造模过程加速了动物的衰老和进一步的神经元损伤及退行性病变，而补肾益智方能阻止这种由造模引起的氨基酸含有量的改变，同时提示补肾益智方有一定的神经保护作用。

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