心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立与评价

2016-05-31李田乐李彤胡晓旻杨帆汪丽红杨玲

天津医药 2016年2期

李田乐，李彤，胡晓旻，杨帆，汪丽红，杨玲

李田乐1，李彤2△，胡晓旻2，杨帆2，汪丽红3，杨玲2

摘要:目的制备一种高稳定性心功能不全合并糖尿病大鼠模型，以期方便于临床和实验室研究。方法取清洁级雄级Wistar大鼠45只，随机分为3组，A组（正常组）10只，B组（腹主动脉缩窄组）10只，C组（腹主动脉缩窄合并糖尿病组）25只。首先对B、C组大鼠采用腹主动脉缩窄的方法构建心功能不全模型，缩窄2个月后，将C组大鼠随机分为5个亚组，C1～5，分别采用单次腹腔注射40、45、50、55、60 mg/kg链脲佐菌素（STZ）的方法诱导心功能不全合并糖尿病大鼠模型。实验过程中动态观察大鼠一般状况及体质量改变，监测STZ注射后72 h、4周大鼠血糖水平，并于STZ注射后1个月对各组大鼠进行心脏超声及心肌病理改变评价。结果对比不同剂量，STZ为45 mg/kg时，构建模型稳定性高且成模大鼠一般状况、血糖水平、心脏超声、心肌组织镜下形态学较正常组发生明显变化，符合心功能不全合并糖尿病改变。结论采用腹主动脉缩窄2个月后腹腔单次注射45 mg/kg STZ的方法诱导心功能不全合并糖尿病动物模型，方法简便可靠，稳定性高。

关键词：心功能不全；糖尿病，实验性；腹主动脉缩窄；疾病模型,动物；大鼠, Wistar

△通讯作者E-mail:litong_3zx@sina.com

心功能不全是由于各种原因所致的初始心肌损伤引起的心肌结构和功能的变化，从而导致心脏泵血功能低下，最终发生心力衰竭，这个过程通常经历一个心肌肥厚、心脏重塑、心功能从代偿到失代偿的演变。糖尿病则是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，临床称之为冠心病的等危症。最新研究显示，糖尿病患者心力衰竭发生率约为14.1%[1]，心衰患者糖尿病发病率更是高于普通人群[2]，然而其内在机制却有待于进一步阐明。随着循证医学的不断发展和人体试验伦理道德的诸方面约束，疾病发生、发展机制的研究在某种程度上更加依赖于动物实验。本研究旨在构建高稳定性心功能不全合并糖尿病大鼠模型，为后期临床和实验室疾病发生机制、药物治疗的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料健康清洁级雄性Wistar大鼠45只，2月龄，体质量（190±15）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有大鼠饲养于天津市第三中心医院动物实验中心，室温20～23℃，相对湿度55%～70%，自由饮食，分笼饲养。所有操作程序严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）的实验动物饲养和使用手册。链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司），-20℃冻存，柠檬酸、柠檬酸钠（国产分析纯试剂），血糖试纸盒（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司），GIQ400CL彩色超声心动仪，9 MHz探头（GE medical system，美国）。

1.2方法

1.2.1动物分组大鼠按随机数字表法分为3组：正常组（A组）10只，腹主动脉缩窄组（B组）10只，腹主动脉缩窄合并糖尿病组（C组）25只。

1.2.2B组建模参照Ma等[3]的方法，大鼠适应性喂养1周，术前禁食12 h，3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，四肢固定、脱毛，常规碘伏消毒，分层打开腹腔，在左肾上暴露腹主动脉并在双肾动脉上方钝性分离腹主动脉，狗头夹夹闭腹主动脉，缺血预适应3次，时间分别为15、30、60 s，之后将7号注射针头去尖后平行置于动脉外壁，用4号手术丝线将二者一起扎紧后将针头迅速移去，覆盖肠管，1 min后观察腹主动脉管腔环形缩窄程度，脏器回位、关腹，用2 mL注射器抽气并注入4万单位抗生素，术后复温，禁食水24 h后常规饲养。

1.2.3C组建模首先参照上述方法，构建心功能不全动物模型，建模2个月后，将此组动物按随机数字表法分为5个小组，标号为C1、C2、C3、C4、C5，每小组5只，然后进行单次腹腔注射STZ建立糖尿病模型，STZ剂量分别为40、45、50、55、60 mg/kg。注射STZ 72 h后测定大鼠尾静脉随机血糖，采血后红霉素处理伤口，预防感染，造模成功后间隔2 d换垫料1次。

1.2.4糖尿病成模判断标准以随机血糖≥16.7 mmol/L[4-5]作为糖尿病大鼠成模标准，同时结合观察注射STZ后平均进食量、进水量、活动量、体毛松散程度、精神萎靡情况、垫料湿度等，并定期监测血糖和体质量。

1.2.5大鼠心脏超声检查心功能不全诱导3个月后对大鼠行超声心动图检查，实验中超声测定大鼠心率（HR）、射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）、左室质量（LV-mass）、心脏舒张末期室间隔厚度（IVSD）、左室舒张末期内径（LVd）和收缩末期内径（LVs）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWD）及二尖瓣血流频谱E/A等，每个指标取3个连续心动周期测量的均值。

1.2.6心肌组织病理观察腹主动脉缩窄后3个月，取大鼠心脏，生理盐水冲洗，10%中性福尔马林固定左室心肌组织，标本石蜡包埋，切片，常规HE染色。光镜下观察心肌细胞及心肌间质的变化。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0软件分析数据。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间多重比较用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠体质量、饮水饮食变化及一般状态观察3组大鼠初始体质量比较差异无统计学意义，1个月时，由于受手术创伤的影响，B、C组体质量较A组下降，差异有统计学意义（P < 0.01），2个月时，3组体质量比较差异无统计学意义。注射STZ后（3个月时），C组体质量较A组、B组降低（P < 0.05），见表1。同时C组表现出多饮，多食，活动量减少，体毛松散、潮湿，精神萎靡，垫料呈酸臭味。

Tab. 1 The weight changes in three groups表1　各组大鼠不同时期体质量变化（g，±s）

＊＊P < 0.01；a与A组比较，b与B组比较，P < 0.05；表2、3同

组别A组B组C组F n 10 10 25 0个月192.80±8.75 197.30±11.24 194.56±9.06 0.575 1个月300.10±15.54 281.67±10.57a280.24±7.82a13.318＊＊2个月366.70±10.69 360.89±16.93 364.72±11.40 0.530 3个月420.10±13.06 405.44±11.24a228.46±18.90ab564.460＊＊

2.2造模前后大鼠血糖水平变化各组大鼠基础血糖水平差异无统计学意义，腹主动脉缩窄后2个月，B组较A组大鼠血糖无明显改变。STZ注射72 h，C组大鼠血糖逐步趋向稳定，大部分血糖水平≥16.7 mmol/L，较A、B组升高（P < 0.05），且持续至第4周，未见转复。由于C1、C5亚组大鼠仅少量成模，因此，最终对其数据未进行统计学处理，见表2。

Tab. 2 The levels of blood glucose before and after modeling in three groups表2　各组大鼠造模前后随机血糖变化（mmol/L，±s）

组别A组B组C1组C2组C3组C4组C5组F n 10 10 55555基础血糖6.71±0.87 6.59±0.45 6.42±0.46 6.36±0.33 6.58±0.51 6.22±0.33 6.60±0.27 0.714 72 h血糖6.40±0.39 6.32±0.31 -23.06±2.51ab24.66±3.12ab26.84±3.23ab-194.779＊＊4周血糖6.24±0.35 6.46±0.49 -22.30±0.41ab27.83±0.51ab29.20±1.21ab-2 456.649＊＊

2.3大鼠超声心动图检查腹主动脉缩窄3个月后，对B组和C组（C2～4）大鼠进行超声检查结果示，B组共10只，成模9只；C组大鼠共25只，成模11只。B组LV-mass、IVSD、LVs、LVPWD均较A组升高（P < 0.05）；C组HR、LV-mass、IVSD、LVs、LVP⁃WD均较A组升高（P < 0.05），B、C组E/A较A组下降（P < 0.05），各组EF、FS、LVd的差异无统计学意义，见表3。

2.4大鼠心肌组织不同切面病理改变A组横切及纵切镜下见心肌纤维排列整齐，心肌细胞大小、细胞核形态无异常，无血管扩张及血管周围细胞浸润等表现。B组镜下显示心肌纤维排列较前紊乱，局部心肌细胞肥大，心肌细胞间间隙增宽，间质中少量炎症细胞浸润。C组镜下显示心肌纤维排列紊乱，血管壁外炎细胞浸润，局部心肌细胞肥大，部分核大深染，心肌细胞间间隙增宽，间质中大量炎症细胞浸润。见图1。

Tab. 3 The echocardiographic results in three groups表3　大鼠心脏超声检查　(±s )

组别A组B组C组F n 10 9 11 HR（次/min）342.50±26.52 349.22±19.64 364.00±21.54a2.450 EF 0.70±0.03 0.69±0.03 0.68±0.03 0.733 FS(%) 49.91±0.94 50.97±0.64 50.12±0.66 0.218 LV-mass(g) 0.70±0.08 0.83±0.06a0.91±0.07ab21.584＊＊组别A组B组C组F n 10 9 11 IVSD(mm) 1.41±0.11 1.50±0.05a1.52±0.04a6.929＊＊LVs(mm) 2.27±0.19 2.46±0.09a2.42±0.11a5.035＊LVd(mm) 4.98±0.13 5.03±0.08 5.05±0.09 1.109 LVPWD(mm) 1.43±0.06 1.62±0.10a1.64±0.10a17.427＊＊E/A 1.53±0.08 1.39±0.05a1.38±0.05a20.025＊＊

Fig.1 HE staining of myocardial different facets（×200）图1　各组大鼠心肌组织不同切面HE染色（×200）

3　讨论

随着基础和临床研究的深入，心功能不全已不再被认为是单纯的血流动力学障碍，而是由于多种神经体液因子的参与，促使心功能不全持续发展的临床综合征。糖尿病则是心血管疾病死亡的独立危险因素。多年前欧洲糖尿病研究协会（European As⁃sociation for the Study of Diabetes，EASD）就曾指出，2型糖尿病发生时，患者即存在一级心衰，糖尿病并发心衰是老年糖尿病患者最主要的转归，在临床上2型糖尿病合并心功能不全的发病率和死亡率明显高于一般人群，是非糖尿病患者的4～8倍。同时国外一项研究表明，糖尿病在心功能不全和正常的心衰患者中的患病率分别为28%和26%[6]，严重影响患者预后。为了更好地研究其内在的发生发展机制，本研究首先对此混合疾病动物模型的构建进行了初步探讨。

本研究采用传统腹主动脉缩窄[3]和STZ破坏胰岛细胞[7]的方法构建动物模型，实验组采用7号注射针头（去尖），缩窄后腹主动脉外径减少约40%～ 50%，这与相关文献报道[8]略有差异，可能与针头大小、缩窄技巧与力度不一所致。对于传统糖尿病造模，STZ剂量国内外文献报道不一[9]，总结原因，可能与动物种类、实验条件、缓冲液性质、注射部位及动物耐受性不同有关。而对于在心功能不全的基础上构建糖尿病大鼠模型，所需STZ剂量鲜见相关报道。本研究所用剂量分别为40、45、50、55、60 mg/kg，结果显示：对于腹主动脉缩窄动物而言，在注射剂量为40 mg/kg时，仅部分大鼠血糖出现升高，随着时间延长，大部分大鼠血糖呈现下降趋势，表明糖尿病建模不成功，推断可能原因是STZ剂量太小，胰岛细胞破坏量少，且受损胰岛细胞功能可以被正常胰岛细胞代偿，最终血糖下降，恢复正常水平。当注射剂量为45～50 mg/kg时，所构建的大鼠模型稳定性高，死亡率低，结合STZ成本，推荐优先考虑45 mg/kg为最佳实验剂量。当STZ剂量≥55 mg/kg时，动物后期血糖一直处于高水平且未见下降趋势，大鼠日渐消瘦、并发症和死亡率明显升高，考虑原因为大剂量STZ导致大鼠胰腺大量破坏，最终糖、脂以及电解质代谢发生严重紊乱。本研究同时显示：对于心功能不全合并糖尿病大鼠，造模后动物表现出明显的糖尿病症状，体质量较正常组及腹主动脉缩窄组明显下降，这与Pandey等[10]报道一致，推断原因可能与其胰岛素分泌不足，机体不能充分利用葡萄糖，使脂肪和蛋白质分解加速来满足能量代谢有关；后期大鼠心肌病理及心脏超声进一步证实心肌出现肥厚改变，这与Dai等[11]研究结果相符，提示模型构建成功。笔者曾尝试对于混合模型的构建顺序进行改变，即先进行糖尿病建模，再行腹主动脉缩窄，但总体成模率低，主要原因是糖尿病动物血糖值高，对手术耐受性差，术后易感染，导致并发症多、死亡率高。

综上所述，采用腹主动脉缩窄2个月后单次腹腔注射45 mg/kg STZ的方法建立心功能不全合并糖尿病动物模型，方法简便、可靠，所需STZ剂量小，建模后期动物血糖稳定，死亡率低，适合实验室和临床相关疾病发生机制及药物治疗等研究。但对于混合模型构建所需STZ剂量较正常糖尿病建模明显减少的原因，本实验尚未揭示，有待进一步研究。

参考文献

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（2015-06-23收稿2015-09-24修回）

（本文编辑李国琪）

临床研究

作者单位：1天津医科大学三中心临床学院（邮编300170）；2天津市第三中心医院；3天津市港口医院

Establishment and evaluation of rat model of cardiac insufficiency complicated with diabetes mellitus

LI Tianle1, LI Tong2△, HU Xiaomin2, YANG Fan2, WANG Lihong3, YANG Ling2
1 The Third Central Clinical Medical College of Tianjin Medical University, Tianjin 300170, China; 2 Tianjin Third Central Hospital; 3 Tianjin Port Hospital
△Corresponding Author E-mail: litong_3zx@sina.com

Abstract:Objective To establish a rat model of cardiac insufficiency complicated with diabetes mellitus (DM), and to meet the needs of clinical and laboratory studies. Methods Forty-five male specific pathogen free (SPF) rats were ran⁃domly divided into three groups: normal control group (A, n=10 ), coarctation of the aorta (AAC) group (B, n=10), AAC+DM group (C, n=25). The model of cardiac insufficiency with abdominal aortic constriction was establish in B and C groups. Af⁃ter two months of AAC, rats of group C were randomly divided into five subgroups and treated with different doses of strepto⁃zotocin (STZ) respectively(40, 45, 50, 55 and 60 mg/kg). The dynamic changes of general condition and weights were ob⁃served during the process of experiment. The blood glucose levels of 72 h and 4 week after STZ injection were detected. The echocardiograph and cardiac pathology changes were evaluated after 1 month of STZ injection. Results The general data in⁃cluding blood glucose levels, echocardiographic findings and myocardial tissue microscopic morphology were compared be⁃

tween different doses of STZ groups. The 45 mg/kg STZ was considered for more stable model of cardiac dysfunction compli⁃cated with diabetes mellitus. Conclusion The rat model of cardiac insufficiency complicated with diabetes mellitus is estab⁃lished by single dose injection of 45 mg/kg STZ after two-month AAC, which is a simple, reliable and high stability method.

Key words:cardiac insufficiency; diabetes mellitus,experimental; abdominal aortic constriction; disease models, ani⁃mal; rats, Wistar

中图分类号：R-332

文献标志码：A

DOI:10.11958/59135

基金项目：天津市卫生局科技基金攻关资助项目（12KG106）

作者简介：李田乐（1990），男，硕士在读，主要从事先天性心脏病研究