膝骨关节炎动物模型研究进展

陈志达　林瀚洋　余志毅　李炳文

【摘 要】 目前膝骨关节炎动物模型的造模方法有很多，各种造模方法各有其优缺点。在进行动物研究时应根据各种膝骨关节炎动物模型的特点、造模机制及研究目的来进行综合考虑，以选择和建立理想的膝骨关节炎动物模型。文章对近年来膝骨关节炎动物模型的研究进展进行综述。

【关键词】 骨关节炎，膝；动物模型；造模方法；综述

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.01.019

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种包括遗传、代谢、发育、应力失衡、创伤、内分泌等生物性和机械性因素相互作用，最终导致膝关节软骨变性、软骨下骨硬化、软骨下骨囊肿和骨赘形成的慢性、进行性骨关节病[1]。KOA发病率随着人口老龄化而逐年上升，严重影响人类的健康[2]。KOA的发病机制复杂，理想的KOA动物模型是研究其发病机制、危险因素及治疗方法等的重要手段。KOA动物模型可分为两大类：自发性动物模型和诱发性动物模型，现对这两类动物模型研究进展综述如下。

1 自发性动物模型

建立自发性KOA动物模型方法主要有天然自发及基因敲除，用于研究的实验动物有C57黑鼠、豚鼠、转基因小鼠，甚至恒河猴等[3]。

1.1 天然自发 Silberberg等[4]首先发现，随着年龄的增长，C57黑鼠能自发形成KOA。但其与人KOA存在一定的差异，主要表现为滑膜炎症不明显，关节软骨剥落呈腐蚀状，无骨棘形成等。进一步研究发现，在自然增龄基础上，增加C57小鼠的运动负荷训练，其运动负荷与KOA的自发率呈正相关[5]。Muraoka等[6]通过连续观察12月龄的雄性Hartley豚鼠膝关节，可见软骨表层破损，胶原溶解断裂，表层软骨细胞丢失，其病理变化与人KOA十分相似。天然自发KOA动物模型受外界因素干扰少，但造模周期相对较长，因此在研究中限制了其应用。

1.2 基因敲除 随着转基因技术的发展，转基因动物模型为KOA研究提供了新的选择。动物研究发现，在骨关节炎（osteoarthritis，OA）的疾病过程中，通过基因敲除调控软骨细胞凋亡的相关基因会造成软骨细胞的过度凋亡，最终导致OA的发

生[7-8]。Del1转基因小鼠在3个月时膝关节的关节软骨就有表浅的原纤维形成，这种表面的缺陷迅速进展为侵蚀，并伴随着关节内各种结构的退变，软骨下骨外露和囊肿形成[9]。敲除小鼠CoL11A1基因后，可引起a1（Ⅺ）软骨胶原蛋白链缺损，导致小鼠的软骨发育不全出现KOA表现[10]。郝振明等[11]用双向电泳技术结合肽质量指纹谱技术发现，Smad3敲除小鼠自发的KOA主要与关节基质成分的减少有关。

其他关于基因修饰的方法还有膜聚糖和纤维调节素基因、解整合素金属蛋白酶-15基因、基质金属蛋白酶-14基因和白细胞介素（IL）-6基因敲除等[12]。虽然通过转基因的方式能够成功建造KOA动物模型，但其发病机制是由于基因异常引起且实验费用高昂，与人KOA的发病机制是否一致还存在一定争议。

2 诱发性动物模型

2.1 药物诱发 多种化合物注入实验动物的膝关节后，可以诱导实验动物出现类似人KOA的病理改变。由此可见，关节内环境与关节软骨代谢关系密切相关，该造模方法是研究药物治疗较理想的方法。常用的药物包括：木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原等。

2.1.1 木瓜蛋白酶 韩冠英等[13]在兔膝关节腔内注射不同浓度的木瓜蛋白酶诱导关节软骨退变，

1周后出现组织炎性反应，6周后发现关节软骨及滑膜变性，且所造KOA模型的严重程度与木瓜蛋白酶注射的浓度及观察时间成一定正比关系。

2.1.2 胶原蛋白酶 邓宇等[14]将新西兰兔随机分成2组，并将木瓜蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶溶液分别注入兔膝关节中，6周后其大体及显微镜病理检查均显示内侧胫骨平台关节软骨呈炎性退变，且胶原蛋白酶组的软骨退变程度较木瓜蛋白酶组严重。

2.1.3 尿激酶型纤溶酶原 石辉等[15]在兔膝关节腔注射尿激酶型纤溶酶原激活物，分别在光镜下观察4，8，12周的关节滑膜、软骨变化，发现尿激酶可使软骨发生退变，且随着时间的延长，关节软骨退变的程度逐渐加重，12周后形成KOA模型，并符合KOA的组织病理特征。

2.1.4 其他药物 菲律宾素、肾上腺皮质激素、透明质酸酶、软骨碎片或异物等注入实验动物关节腔，也可导致关节软骨的退变[16]。

2.2 寒冷诱发 当人体的四肢关节长期处于寒冷环境时，局部血管收缩，血液循环不畅，致使组织缺血缺氧，同时寒冷可诱导细胞凋亡，破坏正常软骨及滑膜细胞的生存环境，随着细胞代谢产物的增多，引起肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1、IL-6等多种炎症因子及趋化因子升高，最终引起关节软骨细胞和基质的降解[17-18]。张志胜等[19]对鸡膝关节每日进行持续2 h的冰浴，30 d后制备软骨石蜡切片，结果发现，软骨细胞出现排列紊乱，毛细血管滋生及胶原纤维减少等软骨退化现象。刘杰等[20]采用冷水刺激小鼠膝关节，30 d后血清学检查发现，模型小鼠血清中透明质酸和TNF-α含量显著升高，苏木精伊红染色显示小鼠出现典型的KOA病变症状。综上研究明确了寒冷刺激对膝关节软骨的直接刺激损伤，导致关节软骨及滑膜的慢性退行性变化，同时为中医的寒邪诱发“痹证”提供理论依据。

2.3 机械诱发 当实验动物的膝关节长期机械制动后，首先出现骨骼肌萎缩、韧带组织结构紊乱、半月板血流量减少、关节软骨损伤等变化，最终出现与临床相似的膝关节退行性变[21]。张洪等[22]用管型石膏将兔膝关节固定在伸直位6周后，观察到兔膝关节软骨变薄、碎裂，滑膜充血水肿，呈现典型的KOA特征。尚平等[23]分别在过伸位和过屈位固定兔膝关节，固定第7，13周后观察兔膝关节软骨的变化，发现2种固定方法均能成功建立KOA动物模型，且过屈位更有利于KOA模型的建立。通过强迫膝关节固定在伸直位或屈曲位虽然能获得KOA动物模型，但在实际操作中可能出现石膏脱落或磨损动物皮肤造成感染而引起死亡。

2.4 手术诱发

2.4.1 前交叉韧带横断术 是近年采用较多的建立KOA动物模型的方法。刘建湘等[24]于直视下切断兔膝关节前交叉韧带，待伤口愈合后，患肢开始负重，随时间推移表层带软骨出现纤维化及软骨细胞数量减少，8周后病变进一步加重，软骨表层大部分细胞消失，说明切断前交叉韧带能够导致KOA，且随着造模时间延长，KOA的病理改变逐渐加重。这可能由于膝关节不稳定时，关节应力发生变化，引起关节的退行性改变。

2.4.2 Hulth法[25] 采用Hulth法切除实验动物前后交叉韧带、内侧副韧带及内侧半月板，造成关节失稳、关节面的摩擦增加以及半月板所起的缓冲作用的缺失，术后12周可得到KOA模型。王云峰等[26]改良Hulth法，在切断前交叉韧带的同时剔除内侧半月板，成功复制不同时期KOA，观察发现造模2周即有早期OA改变，6，10，14周后分别出现中期、晚期和极晚期KOA改变。李炳辉等[27]在Hulth法的基础上引入直立负重，增加关节内应力，3周后即有早期OA改变，5周后得到稳定中期KOA动物模型。改进的Hulth法不仅缩短造模时间，且建立稳定的KOA中期模型周期短，适用于中早期KOA的基础研究。

2.4.3 半月板切除 李忠等[28]经关节镜切除猪双膝外侧部分半月板，术后12周可见膝关节局限性软骨表面纤维化，伴股骨髁间切迹骨赘形成。谢靖等[29]将内侧半月板切除后，并进行关节软骨病理评分，发现其分值与术后时间呈正相关关系。该法手术创伤小，降低了关节内积血和创伤性滑膜炎对实验的干扰，可以简便、可靠地建立KOA动物模型。

2.4.4 膝关节刻痕法 Marijnissen等[30]将该造模方法与前交叉韧带横断模型相比，发现该法引起滑膜炎症较轻，更符合OA的病理变化。李钊等[31]用小针刀在兔股骨髁软骨面、髌软骨及胫骨平台上刻痕，术后第2天开始强迫动物活动，5周后肉眼观察发现，关节软骨表面粗糙，色泽暗，并可见软骨明显缺损及部分碎片。利用小针刀进行刻痕，避免打开关节腔，大大减少了造模时的损伤，并可避免创伤性滑膜炎的干扰。

2.4.5 血循阻断法 戴七一等[32]通过结扎新西兰兔单侧的臀下静脉、股静脉和大隐静脉，术后8周后光镜下可见：膝关节软骨表面局部凹凸不平，软骨层明显变薄。关节软骨病理评分达到KOA初中期变化。通过结扎臀下静脉、股静脉和大隐静脉造成下肢骨内静脉回流障碍，使得膝关节骨骺附近关节软骨的钙化线增宽及松质骨硬化，可成功获得KOA动物模型，也证实了各种因素造成机体经络气血阻滞不通，不通则痛的中医理论。

2.4.6 应力改变 非生理性关节应力负荷，包括关节应力负荷过大或不足，都会改变软骨的结构，刺激致炎细胞因子和蛋白酶的产生，进而破坏关节软骨合成，加速软骨基质的分解代谢，最终导致关节软骨的退变[33-34]。方航等[35]通过切除大鼠的膝内侧半月板及内侧副韧带后，分别取第1，2，

4周软骨下骨的RNA，并采用全基因表达谱芯片技术研究软骨下骨全基因表达，发现与应力相关的3个重要基因（Postn、Ihh和Bmp5）的表达随时间的延长而增高，可见应力因素的改变是KOA发病的重要因素。朱鸿飞等[36]在无菌条件下造成兔双后肢膝内侧髌韧带2/3缺损，术后每日强迫兔活动1 h，6周后出现关节软骨细胞变化、基质分解破坏、滑膜增生等KOA早期改变。髌韧带的缺损会引起膝关节力线的不稳定，使Q角发生改变，造成髌骨的不稳定，直接影响关节内应力分布情况，从而引起KOA。

3 讨 论

KOA的发病机制复杂，一般认为是多因素联合所致，关节应力改变是其重要原因。建立理想的动物模型是研究KOA病因病机的基础。自发性KOA模型受外界干扰因素少，可排除操作所致的误差，在研究原发性KOA的发病机制、关节软骨生化改变和治疗效果的比较等方面具有极大优势，可帮助研究人KOA众多病理生理改变之间的因果关系。但自发性KOA模型发病过程相对较长，因此在研究中常常应用诱发性动物模型。诱发性动物模型以造成关节应力改变及关节不稳所诱发的KOA模型最常用，其中手术诱发的模型，操作较复杂，创伤大，出血及创伤性滑膜炎易影响KOA早期软骨、滑膜的生化代谢，不宜用于探讨药物对早期KOA的生化影响及观察KOA早期病变；非手术诱发的KOA，其优点在于无关节损伤，不存在创伤性滑膜炎干扰，方法简单，创伤小，成功率高，更接近人KOA的病理过程，可用于观察KOA早期病理改变及研究药物对骨关节病变的影响。

综上所述，动物模型诱发KOA机制各不相同，但共同之处是都出现了软骨的退行性变并继发骨质改变，根据不同的方法所建立的KOA动物模型，对后期实验的影响不尽一致。因此，在选择动物模型时，应考虑KOA模型的特点、不同方法的造模机制、动物的种属及研究目的等。

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收稿日期：2015-08-21；修回日期：2015-09-23