三唑酮和三唑醇在4种动物基质中的残留分析方法研究

郇志博　谢德芳

摘 要 建立一种利用超高压液相色谱串联质谱同时测定猪肉、鸡肉、鸡蛋和牛奶中三唑酮和三唑醇残留的分析方法，其中使用乙腈提取，GC/NH2固相萃取小柱净化。结果显示：建立的分析方法线性、精确度和准确度满足SANCO/12571/2013要求，灵敏度满足CAC要求，而且操作步骤简单，耗时短，对大批量样品来说大大提升了检测效率。

关键词 三唑酮；三唑醇；分析方法；动物源

中图分类号 O657.63 文献标识码 A

三唑酮（Triadimefon）别称“粉锈宁”，由德国拜耳公司于1973年推出，是一种高效、低毒、内吸性强的广谱三唑类杀菌剂，主要用于防治植物真菌病害如锈病、白粉病等。三唑类杀菌剂主要是通过抑制菌体麦角甾醇的生物合成，抑制细胞色素多功能氧化酶的催化反应进而抑制或干扰菌体附着孢及吸器发育、菌丝生长、孢子形成，从而导致病菌死亡。在动植物体内，三唑酮分子中的羰基被还原成羟基，生成三唑醇（triadimenol），三唑醇的杀菌活性要高于三唑酮[1]。由于杀菌性能优越，三唑醇被作为一种单独的药剂在多种作物上登记使用，别名“羟锈宁”，对小麦、玉米、高粱黑穗病、白粉病、锈病、条纹病等防效十分显著[2]。经查询，目前中国三唑酮的登记作物包括菜豆、小麦、番茄、观赏菊花、花生、黄瓜、豇豆、梨树、棉花、苹果树、水稻、甜菜、豌豆、西瓜、橡胶树、烟草、油菜、玉米、水稻，涉及318家企业的824种农药产品；三唑醇的登记作物包括：小麦、高粱、花生、水稻、甜菜、香蕉、玉米，涉及21家企业的55种农药产品[3]。

三唑酮和三唑醇是中国农业生产中使用非常广泛的2种杀菌剂，但其在作物、土壤和水体中的残留，也给生物安全和健康带来了负面影响[4]。研究发现，三唑酮与三唑醇会产生神经[5]、生殖[6]、內分泌[7]和基因毒性[8]，并有致癌和致畸性[8-9]。为保证2种农药的科学合理使用和消费者的食品安全，中国制定了三唑酮在稻谷、小麦等作物上的26条残留限量标准，制定了三唑醇在稻谷、小麦等作物上的20条残留限量标准[10]。从2种药剂的登记作物来看，玉米、小麦和水稻为主要登记作物，而这些作物是畜禽的主要饲料来源，为保障畜禽产品的食品安全，国际食品法典委员会CAC（Codex Alimentarius Commission）还制定了2种药剂在猪肉、鸡肉、牛奶和鸡蛋等畜禽产品中的残留限量[11]。近年来随着国家对农产品质量安全的重视，农业部要求必须丰富和完善中国的农兽药残留标准体系，其中转化CAC动物源产品中农药残留限量标准是其中的重要一环。开展CAC限量标准转化工作的基础是畜禽产品中农药残留的检测，经查阅，中国目前制定的三唑醇和三唑酮在动物源产品中的残留检测标准包括GB/T 19650-2006[12]、GB/T 23210-2008[13]、GB/T 20772-2008[14]和SN/T 2232-2008[15]，但标准GB/T19650-2006、GB/T 23210-2008和SN/T 2232-2008的定量限低于CAC要求，标准GB/T 20772-2008需要使用繁琐的凝胶渗透色谱净化，而且4个标准都不能同时检测猪肉、鸡肉、牛奶和鸡蛋4种代表性动物源基质。

武婷等[16]建立了利用超高效液相色谱-质谱法测定果蔬中三唑酮残留的方法，王玉健等建立了利用高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中三唑酮残留的方法[17]，黄超群等建立了利用液相色谱-串联质谱测定蔬菜中三唑醇残留的方法[18]，王明月和林靖凌建立了利用超高效液相色谱串联质谱测定香蕉中三唑醇残留的方法[19]，王敬等建立了利用气相色谱/三重四极杆串联质谱同时测定牛奶和奶粉中三唑酮和三唑醇残留的方法[20]，沈伟健等建立了利用气相色谱-负化学离子源质谱测定牛肉中三唑醇残留的分析方法[21]，郑军红等建立了利用液相色谱-串联四极杆质谱测定牛奶中三唑醇残留的分析方法[22]，但目前尚未检索到关于同时测定猪肉、鸡肉和鸡蛋中三唑酮和三唑醇残留的分析方法的文献报道，且王敬等人建立的牛奶和奶粉中三唑酮和三唑醇的残留测定方法检测限较高[20]。由于动物基质不同于植物基质，含有较多的脂肪和蛋白质，大大增加了三唑酮和三唑醇这类脂溶性农药的提取难度，相应的其检测限也往往高于植物基质。因此本研究将建立一种检出限低、操作步骤简单且能同时测定4种动物基质中2种农药的检测方法，为转化CAC动物源产品中2种农药的残留限量标准和优化现行的残留检测方法标准奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 超高压液相色谱仪（Waters ACQUITYTM）；串联质谱仪（AB SCIEX API4000+）；旋转蒸发仪（SENCO）；电子天平（梅特勒，精度0.01 g和0.000 1 g）；低速台式离心机（上海安亭）；超纯水机（优普）；0.22 μm有机滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）；WondaSep GC-e/NH2 SPE小柱（500 mg×6 mL）。

1.1.2 试剂 三唑酮标准品（丙酮；1 000 μg/mL；农业部环境质量监督检验测试中心）、三唑醇标准品（异丙醇；100 μg/mL；农业部环境质量监督检验测试中心）；甲醇、乙腈、甲苯、甲酸（色谱纯；Fisher Scientific）；氯化钠（分析纯；广州化学试剂厂）；超纯水。

1.2 方法

1.2.1 试样制备 鸡蛋样品：取适量新鲜的鸡蛋，去壳，将蛋清和蛋黄搅拌均匀，密封标记，-18 ℃冷冻保存。

鸡肉和猪肉样品：去骨，包含脂肪含量小于10%的脂肪组织，用绞肉机绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于500 g，作为试样，装入清洁容器内，密封标记，-18 ℃冷冻保存。

牛奶（生乳）样品：取不少于500 g代表性的牛奶（生乳）样品，充分混匀，置于样品瓶中，密封标记，4 ℃冰柜中避光保存。

1.2.2 试验室分析 （1）提取。准确称取5克鸡蛋、鸡肉、猪肉或牛奶样品于25 mL离心管中，加入25 mL乙腈和5～10 g氯化钠，振荡提取30 min，4 000 r/min离心5 min，移取10 mL上清液于一个50 mL圆底烧瓶中，旋转蒸干（40 ℃），用5 mL乙腈 ∶ 甲苯（3 ∶ 1，V ∶ V）重新溶解，待净化。（2）净化。将GC-e/NH2（500 mg，6 mL）固相萃取小柱预先用4 mL乙腈 ∶ 甲苯（3 ∶ 1，V ∶ V）淋洗，然后上样，再用5 mL乙腈 ∶ 甲苯（3 ∶ 1，V ∶ V）洗脱2次，收集洗脱液，旋转蒸干（40 ℃）。用2 mL甲醇溶解定容，过0.22 μm有机滤膜后待测。（3）色谱分析。色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B：甲醇；梯度洗脱：0～2 min，90%～15% A；2～4 min，15% A；4～5 min，15%～90%A；流速0.25 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

三唑酮和三唑醇的质谱参数见表1和2。

1.2.3 方法验证 根据欧盟《食品和饲料中农药残留分析的质量控制和验证程序指导文件SANCO/12571/2013》[23]，方法验证包括线性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率和精度。

线性：首先使用甲醇分别配制10 μg/mL的三唑酮和三唑醇的标准储备液，然后再使用甲醇稀释标准储备液配制三唑酮和三唑醇浓度一致的系列混合标准工作液，系列浓度依次为0.005 0，0.007 5，

0.010 0，0.050 0和0.100 0 μg/mL。分别称取4种空白基质，按照1.2.2的步骤进行提取和净化，其中净化过程最后用配制的系列混合标准工作液替代甲醇定容，得到三唑酮和三唑醇的系列混合基质标准溶液，再上机测定，以进样浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积均值（每个浓度3个重复）为纵坐标，绘制标准曲线，得到三唑酮和三唑醇在4种基质中的0.005～0.1 μg/mL范围内基质标准方程和相关系数。

检测限（LOD）：用甲醇配制三唑酮和三唑醇的溶剂标准，然后按照1.2.2的仪器条件进样，根据三唑酮和三唑醇选择的定量离子峰高与基线峰高比值来逐级稀释三唑酮和三唑醇的溶剂标准，将产生3倍噪音信号的（S/N=3）的三唑酮和三唑醇的溶剂标准浓度定为检测限。

定量限（LOQ）：设定为三唑酮和三唑醇的最低添加浓度，且要低于或等于推荐的MRL值，且回收率和相对标准偏差要符合SANCO/12571/2013的要求。

回收率和精度：分别在4种基质中添加三唑酮和三唑醇，添加浓度分别为在鸡肉、鸡蛋和牛奶中分别为0.005 0，0.007 5和0.010 0 mg/kg，猪肉中为0.005 0，0.007 5和0.020 0 mg/kg，其中三唑酮和三唑醇的浓度一致，每个浓度重复5次。然后按照1.2.2的分析方法测定，并根据建立的基质标准方程，采用外标法计算回收浓度，根据SANCO/12571/2013的要求计算回收率和相对标准偏差（SD）。

2 结果与分析

2.1 线性

通过三唑酮和三唑醇的单一标准，分别确定三唑酮和三唑醇的保留时间分别为2.69 min和2.74 min，除了保留时间，按照SANCO/12571/2013对质谱检测方法的要求，每种农药还要分别选择1种母离子和2个子离子（一个用于定性，一个用于定量）来确认目标物，本试验中选择的三唑酮母离子为m/z294.1，定量离子为m/z197.2，定性离子为m/z225.1，选择的三唑醇的母离子为m/z296.2，定量离子为m/z70.2，定性离子为m/z99.2；且较标准品，基质中各离子的丰度比在70%～130%之间。三唑酮和三唑醇在4种基质中的选择离子流图和4种空白基质的选择离子流图见图1。

由于在离子化过程中，基质会对仪器信号产生抑制或者增强效应，因此为排除基质干扰，本试验统一选择基质标准方程对目标物进行定量。通过绘制基质标准曲线得到三唑酮在鸡蛋、鸡肉、猪肉和牛奶中的基质标准方程及相关系数分别为：Y=8.4×106x+1.04×104（r=0.999 9）、Y=7.59×106E+06x+1.24×104（r=0.999 5）、Y=8.4E×106+06x+1.29×104（r=0.999 7）、Y=8.99×106E+06x+1.03×104（r=0.999 9）；三唑醇在鸡蛋、鸡肉、猪肉和牛奶中的基质标准方程及相关系数分别为：Y=1.62×107E+07x+8.0E+03（r=1.000 0）、Y=1.40×107E+07x+1.97×104（r=0.999 8）、Y=1.45×107E+07x+3.01×104（r=0.999 3）、Y=1.42×107E+07x+2.89×104（r=0.999 3）；这些数据表明2种农药在4种基质中，在0.005～0.1 μg/mL的浓度范围内定量离子的丰度呈良好的线性关系。

2.2 检测限和定量限

按照1.2.3中对检测限的要求和对定量限的设定，最终三唑酮和三唑醇的检测限皆为0.001 μg/mL，三唑酮和三唑醇在检测限水平（0.001 μg/mL）的选择离子流图见图2；三唑酮和三唑醇在4种基质中的定量限皆为0.005 mg/kg，三唑酮和三唑醇在4种基质中定量限水平（0.005 mg/kg）的选择离子流见图3。

2.3 回收率和精度

按照SANCO/12571/2013对质谱检测方法的要求，分别选择定量限、MRL值以及二者之间的任意水平作为添加浓度，每个浓度重复5次，分别计算每种化合物在每种基质中的添加回收率和相對标准偏差，结果表明，三唑酮在4种基质中的平均回收率为81.1%～110.6%，相对标准偏差为1.4%～7.7%，三唑醇在4种基质中的平均回收率为75.1%～102.9%，相对标准偏差为1.2%～7.9%，满足SANCO/12571/2013要求，具体数据见表3。

3 討论与结论

方法验证的结果来看，建立的三唑酮和三唑醇在4种动物源基质中分析方法的线性，精确度和准确度都达到SANCO/12571/2013的要求。

虽然目前已经有多篇文献报道了植物基质中三唑酮或三唑醇残留的分析方法，但目前尚未检索到关于动物基质鸡肉、猪肉和鸡蛋中三唑酮和三唑醇的残留分析方法，动物基质不同于植物基质，其含有较多的脂肪和蛋白质，大大增加了三唑酮和三唑醇这类脂溶性农药的提取难度，王敬等[20]人论述到动物基质一般具有较强的基质效应，为减少基质效应，需要更多的净化步骤，相应的使目标物的定量限增高。王敬等[20]建立的测定牛奶和奶粉中三唑酮和三唑醇残留的分析方法，使用乙腈提取，石墨化炭黑/氨基固相萃取柱净化，乙腈 ∶ 甲苯（3 ∶ 1）淋洗，前处理基本和本研究类似，但其使用的气相色谱-三重四极杆串联质谱对三唑酮的响应并不如本研究使用的超高压液相色谱-三重四极杆串联质谱灵敏，其三唑酮的定量限为9.29 μg/kg，本研究为5 μg/kg。沈伟健等[21]建立的利用气相色谱-负化学离子源质谱测定牛肉中三唑醇的分析方法，虽然定量限为3 μg/kg，但要使用正己烷饱和乙腈（含1%冰醋酸）溶液提取80 min，太耗费时间。郑军红等[22]建立的液相色谱-串联四极杆质谱测定牛奶中三唑醇的分析方法，使用乙腈提取，ENVITM-18固相萃取柱净化，前处理步骤简易程度与本研究类似，检出限为2.64 μg/kg，本研究为1 μg/L，因此灵敏度不如本研究，且未同时测定三唑酮。

国际食品法典委员会CAC（Codex Alimentarius Commission）制定的三唑酮和三唑醇在猪肉、鸡肉、牛奶和鸡蛋中的残留限量分别为0.02，0.01，0.01，

0.01 mg/kg，且残留定义为三唑酮和三唑醇之和，即在对动物样品的残留检测过程中2种化合物都要测定，且残留结果为2种化合物残留量之和。现行的检测动物源产品中三唑酮和三唑醇的国家标准或者行业标准只有4个，即GB/T 19650-2006、GB/T 23210-2008、GB/T 20772-2008和SN/T 2232-2008，而国标GB/T19650-2006仅制定了猪肉和鸡肉中三唑醇和三唑酮的检测方法且定量限为三唑酮0.050 0 mg/kg和三唑醇0.075 0 mg/kg，国标GB/T 23210-2008仅制定了牛奶中三唑醇和三唑酮的检测方法且定量限为三唑酮0.066 7 mg/L和三唑醇0.100 0 mg/L，因此依据国标GB/T19650-2006和GB/T 23210-2008不能检测鸡蛋中的三唑酮和三唑醇含量，虽可以检测猪肉、鸡肉和牛奶中的三唑酮和三唑醇含量，但定量限都要高于CAC设置的MRL水平；出入境检验检疫行业标准SN/T 2232-2008仅制定了牛肉中三唑醇的检测方法且定量限为0.005 mg/kg，由于不同基质对目标物的干扰不同，因此也不能直接利用该方法同时检测猪肉、鸡肉、鸡蛋和牛奶中2种目标农药的残留水平；国标GB/T 20772-2008制定了猪肉和鸡肉中三唑醇和三唑酮的检测方法且定量限为三唑酮0.002 mg/kg和三唑醇0.004 mg/kg，虽然该检测标准满足同时检测鸡肉和猪肉中三唑酮和三唑醇的含量且定量限低于CAC设置的MRL水平，但是仍不能检测牛奶和鸡蛋中2种农药的残留水平，而且该标准需要使用繁琐的凝胶渗透色谱来净化样品，每个样品净化时间达到40 min，使检测效率大大降低；由此可见，目前的国标或者行业标准对同时定量检测动物源产品鸡肉、猪肉、鸡蛋和牛奶中的三唑酮和三唑醇存在灵敏度低，检测效率低或/和兼容度不够的问题，而本研究建立的检测方法不仅灵敏度满足CAC要求，而且操作步骤简单，耗时短，对大批量样品来说大大提升了检测效率，而且同时满足4种基质的检测要求，为以后动物源样品中2种农药的检测以及检测方法标准的更新提供了参考。

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