HPLC法测定磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶的含量

章厉劼 王庆红 金晓峰

摘 要：建立了兽药磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶含量的高效液相色谱测定法。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.1%磷酸溶液-乙腈（80：20）为流动相，检测波长为270nm，流速为1.0mL/min，柱温40℃，采用外标法进行定量。磺胺对甲氧嘧啶的线性范围0.005～0.10mg/mL，回归方程为Area=71641.62×Amt+3.01（n=5），相关系数大于0.99999。磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶三个添加浓度的添加回收率均均在98.2%～103.0%之间，RSD分别为0.51%、1.1%、0.87%。该方法简单，准确，稳定性，精密度好，回收率高，可以用于测量磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶的含量。

关键词：磺胺对甲氧嘧啶片；磺胺对甲氧嘧啶；高效液相色谱

Abstract：An HPLC method has been devloped to determine the content of sulfamethoxydiazine in sulfamethoxydiazine Tablets. With eighteen alkyl silane bonded silica as filler， 0.1% phosphoric acid solution - acetonitrile （80：20） as mobile phase. The detection wavelength is 270nm， the flow rate is 1.0mL/min， the column temperature is 40 degrees Celsius， Quantitatively by external standard method. Sulfamethoxydiazine in the linear range of 0.005～0.10 mg/mL， the regression equation is Area=71641.62×Amt+3.01（n=5）， The correlation coefficient is greater than 0.99999. Sulfamethoxydiazine tablets sulfamethoxydiazine add three concentrations were between recoveries were 98.2%～103.0%， and RSD were 0.51%， 1.1%， 0.87%. The method is simple， accurate， stability， precision， high recovery rate， can be used to measure sulfamethoxydiazine Tablets methoxy pyrimidine sulfonamides content.

Key words：sulfamethoxydiazine tablets；sulfamethoxydiazine；HPLC

磺胺对甲氧嘧啶（C11H12N4O3，简称SMD）作为一种磺胺类药，属于长效磺胺。磺胺对甲氧嘧啶用于控制畜禽细菌性疾病和鸡球虫病[ 9 ]，对革兰氏阴性菌有效，对化脓性链球菌、肺炎球菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、鼠疫杆菌、和肺炎杆菌均有良好的抗菌作用，常用作饲料添加剂及畜禽疾病的治疗和预防[ 7 ]。

其具有乙酰化率低，毒性和副作用小，主要经肾脏排泄等优点[ 8 ]。《中华人民共和国兽药典》中磺胺对甲氧嘧啶片[ 1 ]中磺胺对甲氧嘧啶的含量测定采用的是永停滴定法，但在实际检测中，发现该方法稳定性差，怀疑可能是制剂中的辅料干扰了电极的感应，有些厂家生产的磺胺对甲氧嘧啶片用永停滴定法根本无法准确的检测磺胺对甲氧嘧啶的含量，不能有效进行质量控制。

本研究建立了磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶含量的高效液相色谱测定法，并根据《中华人民共和国兽药典》中“兽药中药质量标准分析方法验证指导原则”[ 1 ]对新建方法的准确度、精密度、专属性、耐用性、稳定性及线性等进行了研究。

1 材料

1.1 仪器和试药

Agilent 1260 Infiinity高效液相色谱仪（配紫外检测器）；

ZYT-1全自动永停滴定仪（无锡科达）；

超声波清洗器（KQ-300DE，昆明市超声仪器厂）；

BP211D型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；

磺胺对甲氧嘧啶钠对照品（Dr.Ehernstorfer GmbH公司，批号：10228，含量：99.0%）；

磺胺对甲氧嘧啶原料（湖北欣达利生化有限公司，批号为：20121001）试验样品由成都乾坤动物药业有限公司生产提供（批号：20130101、20130102、20130103，规格：0.5g）；

乙腈（色谱纯）；

水为超纯水；其他试剂为分析纯。

2 方法

2.1 药典方法

《中华人民共和国兽药典》2010年版一部中“磺胺对甲氧嘧啶片”含量测定項下方法[ 1 ] 。

2.2 色谱方法

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm；柱温：40℃；0.1%磷酸溶液-乙腈（80：20）为流动相；流速：1.0mL/min；检测波长为270nm[ 3 ]；进样体积为20μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

取磺胺对甲氧嘧啶钠对照品约54mg（相当于含磺胺对甲氧嘧啶50mg），精密称定，置50ml量瓶中，加盐酸10mL，超声处理（功率250W，频率20kHz）5分钟，取出，加水稀释至刻度。即得浓度为1.0mg /mL的磺胺对甲氧嘧啶对照品储备溶液。精密量取5mL滤液置于100mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得50μg/mL的磺胺对甲氧嘧啶对照溶液。

2.2.3 供试样品处理

取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于磺胺对甲氧嘧啶0.2g）置200ml量瓶中，加鹽酸10mL，超声处理（功率250W，频率20kHz）5分钟，取出，加水稀释至刻度。精密量取5mL滤液置于100mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

3 结果

3.1 药典方法

取成都乾坤动物药业有限公司提供的批号为20130101、20130102、20130103的磺胺对甲氧嘧啶片及湖北欣达利生化有限公司生产的批号为20121001的磺胺对甲氧嘧啶原料药物按2.1项进行处理测定。以测定结果的相对偏差RSD表示试验的精密度，RSD分别为8.30%、4.86%、13.96%、0.18%。

可见成都乾坤动物药业有限公司提供的磺胺对甲氧嘧啶片检测结果稳定性差，偏差较大，而磺胺对甲氧嘧啶原料药物的检测结果稳定性较好。

原因可能是成药制剂中某种辅料对电极的电流造成干扰，使全自动永停滴定仪无法准确判断终点，而原料药物中没有这种辅料，所有电极不受干扰，检测结果稳定、偏差小。结果见表1。

3.2 色谱方法

3.2.1线性范围

精密量取1.0mg /mL磺胺对甲氧嘧啶对照品储备溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mL，分别置于100mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，得含甘草酸浓度分别为0.005、0.01、0.025、0.050、0.10mg/mLmg/mL的对照溶液系列。注入高效液相色谱仪。

磺胺对甲氧嘧啶浓度在0.005～0.10mg/mL范围内，有良好的线性关系，回归方程为Area=71641.62×Amt+3.01（n=5），相关系数大于0.99999，对照品溶液色谱图及标准曲线见图1。

3.2.2精密度

取成都乾坤动物药业有限公司提供的批号为20130101、20130102、20130103的磺胺对甲氧嘧啶片各10片，精密称定，研细。批号为20130101称取6份，批号为20130102、20130103各取2份，按2.2.3项进行处理，每个样品进样2针，进行含量测定，以Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm为色谱柱，采用50μg/mL的磺胺对甲氧嘧啶对照溶液进行单点定量（除非特别说明，均以Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm为色谱柱，用50μg/mL的磺胺对甲氧嘧啶对照溶液进行单点定量计算，下同）。供试品溶液色谱图见图2。RSD分别为0.27%、0.41%、0.16%，表明方法的精密度良好。结果见表2。

3.2.3准确性

称取湖北欣达利生化有限公司生产的批号为20121001的磺胺对甲氧嘧啶原料药物3份，按2.2.3项进行处理，每个样品进样2针，进行含量测定。结果见表3。

称取2.2中研细的批号为20130101的磺胺对甲氧嘧啶片9份，按高（H）、中（M）、低（L）三个浓度水平分加添加磺胺对甲氧嘧啶原料药物，每个浓度添加3份，按2.2.3项进行处理，每个样品进样2针，进行含量测定。结果见表3。

结果表明，三个添加水平的磺胺对甲氧嘧啶的回收率均在98.2%～103.0%之间，RSD分别为0.51%、1.1%、0.87%，方法具有良好的准确性。

3.2.4耐用性

取2.2项下处理的样品，保持流动相比例不变，使用Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm色谱柱，柱温：30℃，流速：0.9mL/min下进行测试，磺胺对甲氧嘧啶片含量分别为98.2%、96.0%、97.8%；使用安捷伦 ZORBAX SB-C18 5μm 4.6×250mm，柱温：40℃，流速：1.0mL/min下进行测试，磺胺对甲氧嘧啶片含量分别为97.2%、95.8%、97.3%。三种色谱条件下测定结果无明显差异，说明耐用性良好。

3.2.5专属性

在样品测试色谱图中，标准出峰时间附件未发现明显的干扰峰。取不含磺胺对甲氧嘧啶的溶液测定，在磺胺对甲氧嘧啶的保留时间，也没有对应峰。可见方法的专属性良好。

3.2.6稳定性

取3.2.2的供试品溶液，放置5天后，再次测定，磺胺对甲氧嘧啶含量分别为97.4%、96.8 %、97.9%，与3.2.2的测定结果无显著差异，说明稳定性好。

4 讨论与结论

4.1 色谱条件的优化

参考其他磺胺类药物的含量测定、磺胺类药物残留检测方法及相关文献杂志，高效液相色谱法测定磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶所使用的流动相系统有磷酸盐溶液-甲醇（65+35）[ 3 ]、磷酸二氢钾（0.5mol/L）-磷酸氢二钠（0.5mol/L）-甲醇（40：40：20）[ 4 ]、0.017 mol/L磷酸-乙腈（80+20）[ 5 ]、0.1%磷酸溶液-乙腈（90∶18） [ 6 ]等。采用流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈（80：20）时，配置简单，对色谱柱的柱效损伤小。

磺胺对甲氧嘧啶的出峰时间适当，峰形良好，理论塔板数均也能达到《中华人民共和国兽药典》[ 1 ]规定要求。

4.2 样品处理的优化

在进行样品处理的过程中，分别采用10mL盐酸、20mL盐酸、10mL稀盐酸、10mL 0.4%的NaOH[ 2 ]溶液溶解后，超声处理5～10min，然后再加水定容。发现采用10mL盐酸溶解，可以降低成分制剂中辅料对磺胺对甲氧嘧啶的吸附，增强磺胺对甲氧嘧啶的溶解，从而提高磺胺对甲氧嘧啶的回收率。且供试品溶液不会因酸度太高而影响到C18柱的柱效与寿命。

4.3 色谱条件的改变

保持流动相比例和流速不变，分别在岛津LC2010及Agilent 1260 infinity 色谱仪上分别使用菲罗门Luna 5μ C18（2） 5μm 4.6×250mm色谱柱和ZORBAX SB-C18 5μm 4.6×250mm色谱柱于30℃及40℃条件下对样品进行测试，磺胺对甲氧嘧啶的保留时间有变化，但检测结果无影响。可见方法适用于不同设备、不同色谱条件下。

4.4 对比

3.1和3.2.3分别用永停滴定法及高效液相色谱法对湖北欣达利生化有限公司生产的批号为20121001的磺胺对甲氧嘧啶原料药物进行了含量测定，含量分别为90.7%和91.3%，两种方法的结果偏差为0.33%。可见两种方法的检测结果基本一致，也证明了高效液相检测方法的准确性与可行性。

4.5 建立磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶含量的高效液相色谱法测定是可行的

各方法学指标均比较理想，可以作为磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶含量检测标准。现有方法采用永停滴定法测量磺胺对甲氧嘧啶含量，最少操作容易，设备要求简单，运行成本低，但测定时无法与磺胺间甲氧嘧啶区分，还需要作硫酸铜沉淀的鉴别反应来鉴其真伪，且遇到辅料对电极会造成干扰的情况时，是无法对磺胺对甲氧嘧啶的含量进行准确测量的。

在科学日益进步，实验室检测条件及检测能力不断提升的时代，高效液相色谱法更适合于永停滴定法检测磺胺对甲氧嘧啶片中磺胺对甲氧嘧啶的含量。

参考文献：

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