枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊生长发育及代谢活动的影响

高欢欢 葛温伯 覃冬云 于毅

摘要：韭菜迟眼蕈蚊幼虫又称韭蛆，是韭菜等多种蔬菜上的主要害虫，化学防治作为其主要的防治方法，造成严重的农药残留问题。为了明确枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊的作用，进一步寻找防治韭蛆的新方法，本研究利用枯草芽孢杆菌侵染不同虫态的韭菜迟眼蕈蚊，观察其生长发育情况以及韭蛆体内代谢酶活性的变化。结果表明，枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊卵孵化率、蛹羽化率及成虫产卵量均无显著影响，但韭蛆对其反应较为敏感，存活率显著下降。四龄幼虫体内代谢物质检测结果显示，枯草芽孢杆菌侵染后，其体内的海藻糖、蛋白质含量及脂肪酶活性均无显著变化；纤维素酶活性显著提高；几丁质酶、a-淀粉酶、碱性磷酸酶的活性显著或极显著降低，这与韭蛆存活率下降和寿命缩短有一定相关性。因此，枯草芽孢杆菌可以通过调节韭蛆体内部分代谢酶的活性来影响其生长发育，为韭蛆的防治提供新方法。

关键词：韭菜迟眼蕈蚊；枯草芽孢杆菌；生长发育；代谢酶活性；防治方法

中图分类号：S436.33

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）02-0089-05

韭菜迟眼蕈蚊（BradVsia odoriphaga Yang etZhang）属双翅目、长角亚目、眼蕈蚊科、迟眼蕈蚊属。其幼虫又称韭蛆，取食范围十分广泛，可为害百合科、菊科、藜科、十字花科、葫芦科、伞形科等多种蔬菜，尤其是韭菜，致使其产量损失严重。韭蛆危害分布非常广泛，全国各地均有发生，除中国以外，中东、欧洲、北美以及东亚其他地区也有发生。在韭蛆的防治方面，化学防治仍然是目前最有效的方法，但农药的持续使用已经导致农药残留、土壤污染以及抗药性等多种问题的产生，因此，低毒高效的综合防治方法是防治韭蛆危害亟需解决的问题。

韭蛆具有钻蛀性，韭菜根部受到危害后易腐烂，同时滋生大量微生物。高欢欢等从韭蛆体内，韭菜鳞茎、根部及其周围土壤中分离出25种微生物，其中枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在韭蛆和韭菜体内均有发现。枯草芽孢杆菌作为一种肠道微生物已在多种昆虫体内发现，其菌体在生长发育过程中产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等多种活性物质，对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。a-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶是昆虫体内物质代谢必不可少的酶；韭菜迟眼蕈蚊以取食韭菜为主，韭菜中纤维素的降解和利用离不开纤维素酶；几丁质酶作为蜕皮和变态过程中的重要酶类，在昆虫的生长发育中发挥着重要作用；碱性磷酸酯酶在生物体中直接参与磷酸基团的转移和代谢过程，是生物体内一种重要的调控酶，对昆虫的防御体系以及滞育时间有调控作用。

本研究通过枯草芽孢杆菌侵染，观察韭菜迟眼蕈蚊生长发育的变化规律以及韭蛆体内a-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、几丁质酶和碱性磷酸酯酶活性的变化，从而明确枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊生长发育和代谢活动的影响，为韭蛆的防治提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试虫源 韭菜迟眼蕈蚊幼虫饲养于山东省农业科学院植物保护研究所实验室，温度为（25±1）℃，湿度为（70±5）%，光周期为16L：8D。取不同发育时期（卵、幼虫、蛹和成虫）的韭菜迟眼蕈蚊用于试验。

1.1.2 试验仪器与试剂 超净工作台（SW-Cj-ZFD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；培养箱（RXZ-328A型，宁波江南仪器厂）；离心机（D-78532，德国Tuttlingen）；紫外分光光度计（EMax Plus微孔板读板机，美国美谷分子）；摇床（HY-6A数显调速多用振荡器，常州荣冠实验分析仪器厂）。

NB培养基，0.01% PBS缓冲液，2%琼脂，BCA法蛋白含量测定试剂盒、脂肪酶活性试剂盒、海藻糖含量试剂盒、植物a-淀粉酶试剂盒、纤维素酶活性测定试剂盒、组织及血液碱性磷酸酶活性测定试剂盒、几丁质酶试剂盒均购自苏州科铭生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 枯草芽孢杆菌活化枯草芽孢杆菌菌株保存于山东省农业科学院植物保护研究所生物防治实验室，在NB培养基上划线培养，重新活化。挑取单菌落过夜摇菌，经稀释和紫外分光光度计测定后，取OD值为1的菌悬液用于试验。

1.2.2 韭菜迟眼蕈蚊卵孵化率及韭蛆寿命试验

在铺有10mL琼脂和两层滤纸的培养皿中轻轻挑入100枚韭菜迟眼蕈蚊的卵，对照组用无菌PBS溶液浸泡卵30min，处理组用OD值为1的枯草芽孢杆菌悬浮液浸泡卵30min，每组10个重复。取同等大小的韭菜段用75%酒精消毒并用无菌PBS缓冲液冲洗后晾干，处理组经菌液浸泡30s后置于相应培养皿中，对照组以PBS缓冲液浸泡代替。处理后的卵放入培养箱内培养，每天观察卵的孵化情况，孵化后记录韭蛆的死亡数量，用于韭蛆寿命的观察试验。

1.2.3 二龄、三龄、四龄韭蛆存活率及体重试验

分别取同日龄的韭蛆二龄、三龄和四龄幼虫，用5%次氯酸钠溶液消毒并清洗，针扎每个幼虫的腹部末端（二龄幼虫体型较小，未经过针刺处理，以避免死亡率过大，影响结果的准确性），处理组用枯草芽孢杆菌悬浮液浸泡30min，对照组用PBS缓冲液代替。处理后用细毛笔轻轻挑人铺有10mL琼脂和两层滤纸的培养瓶中，同时放人消毒处理过的韭菜段（处理方法同上），每组每个虫龄均设10个重复，共60个培养瓶，每个培养瓶50头幼虫。处理后的韭蛆放入培养箱培养，24h后观察韭蛆死亡数量，将存活的韭蛆收集后称重。四龄幼虫保存于-80℃冰箱，用于后续试验。

1.2.4 蛹羽化率试验蛹除无需针刺以外，其他处理方式与幼虫相同，枯草芽孢杆菌处理组和对照组均设置10个重复，处理后的蛹放人培养箱中，每日观察羽化情况直至所有的蛹羽化完成。

1.2.5 成虫产卵量试验分别取20对无菌状态下饲养的成虫置于铺有10mL琼脂和两层滤纸的培养瓶中，同时放人消毒处理过的韭菜段（处理方法同上），每组10个重复。处理后的成虫放人培养箱中，每日更换培养瓶，记录培养瓶中卵的数量，直至成虫死亡。

1.2.6 四龄韭蛆体内蛋白质、海藻糖含量及5种代谢酶活性的测定从-80℃冰箱中取出保存的四龄幼虫，枯草芽孢杆菌处理组和对照组分别10个重复，根据试剂盒的说明书测定幼虫体内蛋白质和海藻糖的含量以及5种代谢酶的活性。

1.3 数据分析

试验所得数据均采用t检验方法进行差异显著性分析，数据分析所用软件为SPSS 17.0。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌对卵孵化率、韭蛆寿命、蛹羽化率和成虫产卵量的影响

由表1可知，与对照相比，枯草芽孢杆菌处理的卵孵化率和蛹羽化率有所下降，成虫产卵量上升，但差异均不显著；而韭蛆寿命则受到枯草芽孢杆菌的显著影响（F=4.75，P=0.04），与对照相比，明显下降。说明枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊卵、蛹和成虫不会造成显著影响，幼虫阶段则较为敏感。

2.2 枯草芽孢杆菌对韭蛆体重和存活率的影响

由表2可知，二龄幼虫和四龄幼虫平均体重在枯草芽孢杆菌侵染后变化不显著，三龄幼虫平均体重则极显著下降（F=13.17，P=0.002）。

由图1可知，二龄、三龄、四龄幼虫存活率均受到枯草芽孢杆菌的显著影响。其中二龄幼虫（F=4.88，P=0.042）和四龄幼虫（F=7.80，P=0.013）的存活率在枯草芽孢杆菌侵染后显著下降。三龄幼虫对照组和枯草芽孢杆菌处理组的存活率均较低，其中对照条件下的存活率为（61.11±6.07）%，处理组却显著上升到（77.11+2.63）%（F=5.86，P=0.028），由此，枯草芽孢杆菌降低了三龄韭蛆的平均体重并使其存活率有所上升，二龄和四龄幼虫的平均体重虽没有显著变化，但存活率显著下降。

2.3 枯草芽孢杆菌对四龄韭蛆体内蛋白质、海藻糖含量的影响

由表3可知，四龄韭蛆体内蛋白质和海藻糖含量在枯草芽孢杆菌侵染后均有所波动，其中蛋白质含量降低，海藻糖含量升高，但差异均不显著。因此，枯草芽孢杆菌对四龄幼虫体内的蛋白质、海藻糖含量并没有造成显著影响。

2.4 枯草芽孢杆菌对四龄韭蛆体内5种代谢酶活性的影响

由图2可知，枯草芽孢杆菌对四龄幼虫体内的纤维素酶、a-淀粉酶、碱性磷酸酯酶、几丁质酶活性有显著或极显著影响。其中纤维素酶的活性在枯草芽孢杆菌侵染后显著升高（F=18.63，P=0.012）；a-淀粉酶酶活性极显著降低（F=13.97，P=0.007）；碱性磷酸酯酶受影响最大，与对照相比，酶活性降低了74.26%（F=23.78，P=0.005）；脂肪酶活性在受到枯草芽孢杆菌侵染后有所上升，但差异并不显著（F=3.26，P=0.11）；而几丁质酶则受到枯草芽孢杆菌的显著影响（F=7.30，P=0.036），活性显著下降。由此，枯草芽孢杆菌的侵染没有引起四龄幼虫体内脂肪酶活性的显著变化，而几丁质酶作为蜕皮和变态过程中的重要酶类，活性显著下降，这与韭蛆寿命的变化一致。

3 讨论与结论

本研究结果表明，枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊卵、蛹和成虫均没有显著影响，这是因为韭菜迟眼蕈蚊的卵有卵壳包被作为保护层，而蛹时期表皮中几丁质含量高，有效阻止了外源物质的侵染，因此韭菜迟眼蕈蚊在未孵化前以及进入蛹期后很难进行防治。进入成虫阶段后，韭菜迟眼蕈蚊取食量非常小，寿命较短，取食外源物质并不能显著改变其产卵量。而枯草芽孢杆菌对韭蛆幼虫的存活率和体重影响较为显著，二龄和四龄幼虫的存活率显著下降，三龄幼虫体重显著下降，但存活率有所升高。这可能是因为三龄阶段是韭蛆危害较为严重的时期，取食量大，代谢活性较强，对外界环境产生了一定耐受力，但其是否与枯草芽孢杆菌形成了协同进化的关系则需要进一步研究。

本研究选择了发育历期最长、代谢活动最为复杂的四龄幼虫作为研究对象进行代谢物质和酶活性的检测，结果表明，枯草芽孢杆菌侵染后，韭蛆体内蛋白质和海藻糖含量以及脂肪酶的活性并没有受到显著影响，而纤维素酶的活性显著提高。几丁质在昆虫生长的每个阶段都必须维持在一定水平内，过多或缺失都将对昆虫造成致命影响，参与糖类代谢的a-淀粉酶以及参与几丁质代谢的几丁质酶在枯草芽孢杆菌侵染后显著降低，同时韭蛆的寿命缩短和存活率下降，说明枯草芽孢杆菌可以通过调节韭蛆体内a-淀粉酶和几丁质酶的活性来影响其生长发育。另外，碱性磷酸酯酶作为一种具有抗逆作用的酶，在昆虫受到外界刺激时会产生活性的变化，以维持体内物质代谢的平衡，枯草芽孢杆菌侵染后，韭蛆体内碱性磷酸酯酶的活性降低幅度最大，达到74.26%，说明碱性磷酸酯酶对枯草芽孢杆菌反应较为敏感。

在农业领域，枯草芽孢杆菌目前主要应用于病害的防治研究，在昆虫防治方面应用较少。本研究通过枯草芽孢杆菌对韭蛆的侵染，发现其改变了韭蛆体内代谢酶的活性，进而对韭蛆的生长发育产生了不利影响。但若单独用枯草芽孢杆菌防治韭蛆，则效果有限，因此可以作为增效剂，结合其他防治方法共同防治韭蛆，其效用如何还需进一步研究。