微波协同复合酶法提取甘孜虎掌菌多糖工艺优化

刘源　杨刚　张孝琴　杨学武

摘要：【目的】优化微波协同复合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工艺条件，为提高虎掌菌多糖提取率提供新的工艺技术。【方法】以甘孜虎掌菌为试验材料、多糖提取率为考察指标，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken中心组合设计及响应面法优化微波协同复合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工艺条件。【结果】影响微波协同复合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的因素顺序为：复合酶用量>酶解温度>微波功率>微波时间，复合酶用量和酶解温度对多糖提取率的影响极显著（P<0.01），酶解温度与微波时间两因素交互作用影响显著（P<0.05），其最佳提取工艺条件为：纤维素酶与木瓜蛋白酶的复合酶质量比1∶1、复合酶用量0.70%、 pH 5.0、酶解温度51 ℃、微波时间4.3 min、微波功率550 W，在此条件下的虎掌菌多糖提取率为16.09%，与模型预测值16.2537%的相对误差为1.02%，误差较小。【结论】建立的模型对甘孜虎掌菌多糖具有较好的预测作用，优化的工艺参数可用于实际生产。

关键词： 虎掌菌；多糖；响应面法；微波协同复合酶法；甘孜

中图分类号： S646.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0442-07

0 引言

【研究意义】虎掌菌（Sarcodon imbricatus）又称獐子菌、翘鳞肉齿菌，其子实体中等至大型，表面有暗灰色至黑褐色大鳞片。中医认为，虎掌菌性平味甘，具有追风散寒、降低胆固醇等作用，同时具有益气补气、治风破血、和胃通便、降血压、解食物之毒、治头痛头昏等功效（赵雨霁和王琦，2014）。已有研究表明，虎掌菌多糖具有抗肿瘤、抗氧化及抑菌活性等作用（才媛，2013；丁祥等，2015）。虎掌菌主要分布于云南省楚雄州和丽江县，目前对云南野生虎掌菌的研究较多（杜萍等，2010；王雪冰，2011）；但海拔3500 m以上的川西高原每年也出产此菌，据调查四川甘孜州的野生虎掌菌年生长量超300 t，其年产量与云南相当，也是我国虎掌菌的主产区之一（陈杭等，2014）。由于开发较晚，目前尚无甘孜虎掌菌的研究报道。因此，研究甘孜虎掌菌的多糖提取工艺，对真菌多糖的药用开发具有重要意义。【前人研究进展】近年来，真菌多糖的提取已由传统水提醇沉法转为酶解法、超声波和微波辅助提取。微波协同酶法提取真菌多糖，是利用酶对细胞壁的破坏，结合微波的高能，促使目标物进入溶剂，从而提高提取率。苗晓燕等（2012）利用微波协同纤维素与果胶酶的复合酶提取猴头菌丝体多糖，在复合酶用量1%、pH 4.2、水浴温度50 ℃、酶解时间30 min、微波功率500 W、微波时间3 min、料液比1∶50的条件下得到多糖提取率为8.01%；黄琼和丁玲（2013）采用微波协同果胶酶提取金针菇多糖，得到提取率为21.76%，比单一微波法提取率提高了13.95%；汪振炯等（2014）对蛹虫草菌丝体采用纤维素酶协同微波法提取，得到18.45%的蛹虫草基质多糖。关于云南虎掌菌多糖提取工艺的研究也有一些文献报道，王雪冰（2011）采用水提、酸碱浸提、酶解、超声波、微波、超临界萃取等6个单一工艺提取云南虎掌菌多糖，并比较不同方法在多糖提取工艺中的利弊；之后，王雪冰等（2011）采用响应曲面法优化水法提取云南野生虎掌菌多糖的工艺条件，得出最佳提取工艺条件为：提取时间3.25 h、提取温度94 ℃、水料比45.5∶1，在此条件下，虎掌菌多糖提取率为9.14%；韦丁（2011）利用热水回流提取法得到黑虎掌菌多糖提取率为2.29%。【本研究切入点】目前关于微波协同复合酶法提取虎掌菌多糖的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】以甘孜虎掌菌为试验材料，以多糖提取率为考察指标，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken中心组合设计及响应面法优化微波协同复合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工艺条件，为提高虎掌菌多糖提取率提供新的工艺技术。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

虎掌菌采自四川省甘孜州稻城县色拉乡，经清水洗净后晾干、粉碎，过50目筛备用。纤维素酶（酶活单位≥50 U/mg，最适温度30～60 ℃，最适pH 4.0～6.5）购自江苏锐阳生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活单位≥100 U/mg，最适温度50～60 ℃，最适pH 5.0～7.5）购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司；葡萄糖、硫酸、苯酚、丙酮、乙醚、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：RE52CS-1旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、MCR-3S微波炉（西安予辉仪器有限公司）、SP-1901型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、FW80-1粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）、HH-2数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司）。

1. 2 多糖提取工艺流程

准确称取甘孜虎掌菌子实体干粉→添加一定量复合酶→加入50%乙醇溶解→调节pH→控制酶解温度→进行微波处理→水浴锅酶解1 h→90 ℃灭酶30 min→抽滤→定容→计算提取率。

1. 3 提取工艺最佳参数确定

在单因素试验中，以分析纯葡萄糖为对照，依次改变不同酶的质量比、复合酶用量、微波时间、微波功率、pH、酶解温度，以虎掌菌多糖提取率为考察指标进行分析。结合实际工艺过程的条件，确定最佳参数再进行响应面分析设计试验。

1. 4 多糖提取率測定

以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准工作曲线，得回归方程：y=0.00631x-0.028（R=

0.9992）。

多糖提取率（%）=提取得到的多糖质量/原料总质量×100

1. 5 统计分析

采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 不同酶质量比对甘孜虎掌菌多糖提取率的影响 在固定pH 5.5、酶解温度50 ℃、微波时间3.0 min、微波功率600 W的条件下，分别添加酶总用量为0.5%的纤维素酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶（质量比1∶2、1∶1、2∶1），结果见图1。复合酶的甘孜虎掌菌多糖提取率均高于单一酶的多糖提取率，且以复合酶质量比为1∶1的多糖提取率最高（15.42%），显著高于单一酶的多糖提取率（P<0.05，下同），但单一酶的多糖提取率与复合酶质量比为1∶2和2∶1的多糖提取率间无显著差异（P>0.05，下同）。最终选择纤维素酶与木瓜蛋白酶以质量比1∶1组成的复合酶进行后续试验。

2. 1. 2 复合酶用量对甘孜虎掌菌多糖提取率的影响 在固定pH 5.5、酶解温度50 ℃、微波时间3.0 min、微波功率600 W的条件下，分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的复合酶，结果见图2。随着复合酶用量的增加，甘孜虎掌菌多糖提取率逐渐升高，复合酶用量为0.6%时达最大值，显著高于复合酶用量0.2%和0.4%的提取率；继续增加复合酶用量，多糖提取率有所下降，但用量在0.6%～1.0%的提取率间无显著差异。最终选择0.4%、0.6%、0.8%的复合酶用量进行响应面试验。

2. 1. 3 酶解温度对甘孜虎掌菌多糖提取率的影响 在固定复合酶用量0.5%、pH 5.5、微波时间3.0 min、微波功率600 W的条件下，设置不同酶解温度分别为35、40、45、50、55和60 ℃，结果见图3。甘孜虎掌菌多糖提取率随着酶解温度的升高而逐渐增大，当酶解温度为50 ℃时达最大值，40～60 ℃的多糖提取率无显著差异，但在50 ℃后呈下降趋势。最终选择酶解温度45、50、55 ℃进行响应面试验。

2. 1. 4 微波时间对甘孜虎掌菌多糖提取率的影响 在固定复合酶用量0.5%、pH 5.5、酶解温度50 ℃、微波功率600 W的条件下，设置不同微波时间分别为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 min，结果见图4。甘孜虎掌菌多糖提取率随着微波时间的延长而逐渐升高，当微波时间超过3.0 min后，多糖提取率间无显著性差异，4.0 min后提取率略有下降。最终选择微波时间3.0、4.0、5.0 min进行响应面试验。

2. 1. 5 微波功率对甘孜虎掌菌多糖提取率的影响 在固定复合酶用量0.5%、pH 5.5、酶解温度50 ℃、微波时间3.0 min的条件下，设置不同微波功率分别为500、550、600、650和700 W，结果见图5。甘孜虎掌菌多糖提取率随着微波功率的增大逐渐升高，当微波功率为550 W时达最大值，除与600 W间无显著性差异外，与其他微波功率均有显著性差异，超过550 W后，多糖提取率快速下降。最终选择微波功率500、550、600 W进行响应面试验。

2. 1. 6 pH对甘孜虎掌菌多糖提取率的影响 在固定复合酶用量0.5%、酶解温度50 ℃、微波功率600 W、微波时间3.0 min的条件下，设置不同pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，结果见图6。甘孜虎掌菌多糖提取率在酸性较大的情况下（pH 4.0～4.5）有显著性差异，但随着pH的增加，在4.5～7.0范围内无显著变化，因此选择pH 5.0（提取率为最大值）进行响应面试验。

2. 2 响应面法优化甘孜虎掌菌多糖提取工艺

2. 2. 1 响应面法试验结果 结合上述单因素试验结果，根据Design-Expert 8.0.6 软件的Box-Behnken中心组合试验设计原理，确定纤维素酶与木瓜蛋白酶的复合酶质量比1∶1、pH 5.0，以复合酶用量、酶解温度、微波时间和微波功率为主要因素，设计4因素3水平响应面分析试验，试验因素水平编码见表1。

采用Design-Expert 8.0.6软件对响应面试验结果（表2）进行多元回归拟合分析，得到模型的拟合曲线方程为：Y=15.78+1.29A+0.76B+0.21C-0.46D-0.27AB+

0.13AC+0.022AD+1.06BC-0.44BD-0.47CD-1.32A2-

1.85B2-1.04C2-2.38D2。

对模型的回归系数和方差分析结果进行显著性检验，由表3可知，该模型的P=0.0001<0.05，表明该模型的回归方程具有显著性。各因素对甘孜虎掌菌多糖提取率影响排序为：A>B>D>C，其中，交互项BC作用显著，一次项A、B和二次项A2、B2、C2、D2作用极显著（P<0.01）。在P<0.05显著水平下剔除不显著项后，对模型式进行优化，其结果为：Y=15.78+1.29A+0.76B+ 1.06BC-1.32A2-1.85B2-1.04C2-2.38D2。

2. 2. 2 响应面分析因素间的交互作用 根据拟合回归方程，绘制两个交互项的响应面图（图7），以考察其对甘孜虎掌菌多糖提取率的影响。响应曲面坡度较平滑，说明响应值受各变量变化的影响较小；反之，响应曲面坡度较陡峭，则说明响应值受变量交互作用较为明显。由图7可知，酶解温度与微波时间之间存在显著的交互作用，而复合酶用量与酶解时间、微波时间、微波功率之间的交互作用，以及酶解温度与微波功率、微波时间与微波功率间的交互作用不显著，与响应面方差分析结果相一致。

2. 2. 3 最佳提取条件的确定和验证 利用Design- Expert 8.0.6软件得到优化的提取工艺为：复合酶用量0.69%、酶解温度51.37 ℃、微波時间4.30 min、微波功率542.57 W，在此条件下甘孜虎掌菌多糖提取率的预测值为16.2537%。综合考虑多糖提取率和试验可操作性等因素，修正最佳工艺条件为：纤维素酶与木瓜蛋白酶的复合酶质量比1∶1、复合酶用量0.70%、pH 5.0、酶解温度51 ℃、微波时间4.3 min、微波功率550 W，在此条件下进行验证，实际测定值为16.09%，相对误差为1.02%。表明该模型推测得到的最佳工艺参数对实际的预测较可靠，有一定指导意义。

3 讨论

目前，关于云南虎掌菌的多糖提取多采用单一工艺完成。王雪冰（2011）采用水提醇沉法提取云南黑虎掌菌多糖的提取率为9.01%，采用微波辅助提取多糖的提取率为16.92%；韦丁（2011）利用热水回流提取黑虎掌菌多糖的提取率为为2.29%。比较发现水提醇沉法耗时多，提取率低；单一微波法的提取率较高，但易破坏活性成分。微波协同复合酶法提取真菌多糖，选择适宜的复合酶配比，使植物细胞壁降解，让多糖成分充分释放，从而提高提取率，目前此法已广泛应用于真菌多糖的提取（朱彩平和肖智敏，2011；苗晓燕等，2012；黄琼和丁玲，2013）。本研究采用微波协同复合酶法从甘孜野生虎掌菌中提取多糖，通过6个单因素考察试验，结合Box-Behnken中心组合设计建立了4因素3水平试验模型，在优化的工艺条件下得到多糖提取率为16.09%，较采用水提醇沉法（王雪冰，2011）、热水回流法（韦丁，2011）的提取率高，也高于同属野生竹荪菌托（吴雪艳等，2015）和青头菌（王静等，2015）的多糖提取率。可见，甘孜虎掌菌多糖含量较高，采用微波协同复合酶法提取甘孜虎掌菌多糖可有效提高提取率。

在本研究中，单因素和两因素交互作用对甘孜虎掌菌多糖提取率的影响表现为：复合酶用量>酶解温度>微波功率>微波时间，其中复合酶用量和酶解温度对多糖提取率的影响极显著，酶解温度与微波时间两因素交互作用影响显著，与黄琼和丁玲（2013）的研究结果一致。在微波协同复合酶法提取多糖的工艺中，还存在其他影响因素，如料液比、酶解时间、提取次数、其他生物酶的选择等，下一步将综合考察这些因素，得出更优的提取方案，以期获得更高的提取率。

4 结论

本研究通过响应面法优化微波协同复合酶法提取甘孜虎掌菌多糖工艺，得到最佳提取工艺条件为：纤维素酶与木瓜蛋白酶的复合酶质量比1∶1、复合酶用量0.70%、 pH 5.0、酶解温度51 ℃、微波时间4.3 min、微波功率550 W，在此条件下的多糖提取率为16.09%，与模型预测值16.2537%的相对误差为1.02%。表明建立的模型对甘孜虎掌菌多糖具有较好的预测作用，优化的工艺参数可用于实际生产。

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（责任编辑 罗 丽）