龄家蚕中肠β—呋喃果糖苷酶基因转录表达分析

杨伟克　唐芬芬　刘增虎　钟健

摘要：【目的】探明5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因表达及其酶活性变化规律，为解析家蚕回避桑叶1-脱氧野尻霉素（DNJ）毒害作用的适应机制提供参考依据。【方法】通过实时荧光定量PCR对5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1和BmSuc2的表达进行定量检测和分析，同时测定β-呋喃果糖苷酶活性。【结果】BmSuc1基因在5龄家蚕中肠的不同发育阶段均有表达，其中在5龄起蚕和盛食期的相对表达量较高；而BmSuc2基因在整个5龄期的相对表达量均非常低。从5龄起蚕到熟蚕，β-呋喃果糖苷酶活性呈先升高后降低的变化趋势，以第5 d（盛食期）的酶活性最高，达158.82 U/mg。【结论】BmSuc1基因表达水平及β-呋喃果糖苷酶活性变化规律与5龄家蚕吸收利用桑叶蔗糖营养的生理进程基本一致，提示BmSuc1基因作为一种蔗糖水解酶基因在家蚕中肠组织消化吸收桑叶蔗糖营养物质的过程中发挥主导作用。

关键词： 家蚕；β-呋喃果糖苷酶；BmSuc1基因；BmSuc2基因；酶活性

中图分类号： S881.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0721-05

Abstract：【Objective】In order to provide reference for illustrating adaptive mechanism of Bombyx mori avoiding toxicity of 1-deoxynojirimycin（DNJ）， the present study was conducted to investigate change regularities of β-fructofuranosidase gene expression and its enzyme activity in the midgut of the 5th instar B. mori larvae. 【Method】The real-time fluorescent quantitative PCR was applied to analyze expression of BmSuc1 and BmSuc2 genes in midgut of the 5th instar B. mori larvae， meanwhile the activities of β-fructofuranosidase were determined. 【Result】BmSuc1 gene was expressed in midgut of the 5th instar larvae at different developmental stages， moreover it was highly expressed at moulting and glutonous stages of the 5th instar larvae， while BmSuc2 gene was lowly expressed all the time at the 5th instar of larvae. Furthermore， the activity of β-fructofuranosidase showed a trend of ascending first and then descending from newly moulted silkworm to matured silkworm， especially at the 5th day of glutonous stage with the highest enzyme activity（158.82 U/mg）. 【Conclusion】The expression level of BmSuc1 gene and Chang of β-fructofuranosidase activity are corresponded with mulberry sucrose metabolism in the 5th instar larvae， therefore， it is revealed that BmSuc1 gene plays a leading role in midgut absorbing sucrose nutrition from mulberry leaves.

Key words： Bombyx mori； β-fructofuranosidase； BmSuc1 gene； BmSuc2 gene； enzymatic activity

0 引言

【研究意義】1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）能够抑制α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）活性，但对β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）没有抑制作用（Krasikov et al.，2001；Kiso et al.，2003）。DNJ能够通过抑制昆虫肠道α-葡萄糖苷酶活性而阻止昆虫分解和吸收蔗糖营养，使其不能正常生长发育，甚至造成死亡（Kite et al.，1997；Asano et al.，2001）。桑树的叶片、枝条和根茎等部位均富含DNJ，寡食性昆虫家蚕一生以桑叶为食物来源，之所以能有效避开桑叶DNJ对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，主要是依赖β-呋喃果糖苷酶分解吸收桑叶中的蔗糖营养（Asano et al.，2001；Daimon et al.，2008；张蕾等，2014）。家蚕5龄期是食桑量最大的阶段，研究此阶段β-呋喃果糖苷酶基因在家蚕中肠的表达变化规律，解析家蚕中肠蔗糖水解酶的功能及其活性，对阐明家蚕回避桑树生物碱DNJ毒害作用的酶学适应机制具有重要意义。【前人研究进展】蔗糖是包括昆虫在内所有动物的主要营养来源，分解蔗糖的水解酶有两种：一种是催化葡萄糖侧基的α-葡萄糖苷酶，另一种是催化果糖侧基的β-呋喃果糖苷酶（Krasikov et al.，2001）。α-葡萄糖苷酶普遍存在于动植物和微生物中，但动物体内不存在β-呋喃果糖苷酶、其蔗糖消化吸收主要依赖于α-葡萄糖苷酶水解作用的观点长期存在，影响着人们的科学判断（Krasikov et al.，2001；Alberto et al.，2004）。早期的研究有报道β-呋喃果糖苷酶存在于少数几种昆虫的肠液中（Santos and Terra，1986；Sumida et al.，1994；Carneiro et al.，2004），但一直未见相关基因的克隆鉴定。直到2008年，Daimon等率先在家蚕基因组中发现两个与细菌性β-呋喃果糖苷酶基因具有较高同源性的基因，分别命名为BmSuc1和BmSuc2，且证实其编码的蛋白质在家蚕中肠中具有β-呋喃果糖苷酶活性特征。另外，有研究表明非食桑昆虫蓖麻蚕和柞蚕的体内也存在β-呋喃果糖苷酶同源基因，其中蓖麻蚕有2个（ScSuc1和ScSuc2），柞蚕有3个（ApSuc1a、ApSuc1b和ApSuc2），但这些基因都不具备β-呋喃果糖苷酶的活性特征，说明β-呋喃果糖苷酶与食桑/非食桑昆虫的食性选择密切相关（张蕾，2014）。【本研究切入点】食桑昆虫家蚕分解桑叶中的蔗糖主要依赖于β-呋喃果糖苷酶而非α-葡萄糖苷酶，因此桑葉中高浓度的DNJ对其无毒害作用。目前，关于家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶活性及BmSuc1和BmSuc2基因表达的变化规律尚无研究报道。【拟解决的关键问题】通过实时荧光定量PCR检测整个5龄期家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因的表达量，并测定此时β-呋喃果糖苷酶的活性，旨在探明BmSuc1和BmSuc2基因及β-呋喃果糖苷酶在5龄家蚕中肠的变化规律，为解析家蚕回避桑叶生物碱DNJ毒害作用的适应机制提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试家蚕为菁松×皓月，人工孵化，饲育温度25.5～ 28.0 ℃，湿度60%～70%，桑叶饲养。取5龄起蚕至熟蚕的中肠组织，每头蚕的中肠组织纵切分成两份，一份用于抽提RNA，另一份用于酶活性测定。每次取样均设3次重复，每个重复取5头蚕，样品收集后置于-80 ℃下保存备用。RNAiso Plus、反转录试剂盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Taq DNA聚合酶和荧光定量试剂SYBR■ Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）均购自宝生物工程（大连）有限公司；蛋白定量测试盒（A045-2）与β-呋喃果糖苷酶活性试剂盒（A082-2）购自南京建成生物工程研究所。

1. 2 RNA提取及反转录

按照RNAiso Plus试剂操作说明提取中肠总RNA，得到的总RNA用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行处理以去除基因组DNA。通过上述方法制备获得的RNA用DEPC水进行1∶50稀释，然后于核酸蛋白分析仪上分别测出OD260和OD280，通过OD260/OD280计算RNA样品浓度；并根据PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒使用说明将RNA反转录成cDNA。另外，取OD260/OD280在1.80～2.00的样品用于实時荧光定量PCR检测。

1. 3 引物设计与合成

利用Primer Premier 5.0软件，按照Real-time PCR要求设计引物。引物序列见表1。

1. 4 目的基因PCR扩增

进行荧光定量PCR检测前，需对设计的引物进行普通PCR检测。一是鉴定引物的特异性及是否有引物二聚体产生；二是初步检测目标基因在家蚕中肠的大概转录情况，为实时荧光定量PCR检测提供定性参考。利用表1中的引物，以反转录获得的家蚕中肠cDNA为模板进行PCR扩增。扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，即在5 v/cm电压下电泳25～30 min，然后在UVP凝胶成像系统上观察并摄影。

1. 5 实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR检测参照SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明进行操作。扩增程序：95 ℃预变性1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。StepOne荧光定量PCR扩增仪记录试验结果，每个样品设3次重复，最后根据2-△△Ct计算基因的相对表达量（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 6 β-呋喃果糖苷酶活性测定

取家蚕中肠样品加入4 ℃预冷的1.0 mL磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0），在冰上匀浆，4 ℃下8000 r/min离心5～8 min，收集上清液。按照蛋白定量试剂盒说明测定蛋白质含量，再根据β-呋喃果糖苷酶测定试剂盒说明测定酶活性。

1. 7 统计分析

采用Excel 2007进行数据处理及制图，利用SPSS 13.0進行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 目的基因的PCR扩增结果

由图1可以看出，从5龄家蚕中肠组织中能分别扩增出单一的BmSuc1和BmSuc2基因条带，且没有明显的引物二聚体条带出现，说明本研究设计的引物可用于实时荧光定量PCR扩增。另外，通过比较扩增片段条带的宽窄、深浅，发现BmSuc1基因的条带较亮，而BmSuc2基因的条带很弱，表明BmSuc1与BmSuc2基因的转录水平存在差异，但其差异需要通过实时荧光定量PCR检测才能进行准确分析。

2. 2 5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因的表达情况

利用实时荧光定量PCR对5龄起蚕至熟蚕的中肠β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1和BmSuc2进行定量分析，结果如图2所示。由图2可以看出，BmSuc2基因转录表达波动较小，从5龄起蚕到熟蚕的相对表达量都非常低；而BmSuc1基因在整个5龄期的相对表达量存在很大差异，其中5龄起蚕时的相对表达量较高，取食第1 d的BmSuc1基因相对表达量有一定程度的降低，从第2 d开始逐渐升高，在第4 d的相对表达量最高，第5 d又开始降低，到第7～8 d降至最低点。BmSuc1基因在整个5龄期呈先减弱后升高再降低的变化趋势，出现一个峰值。说明BmSuc1与BmSuc2基因在5龄家蚕中肠的转录表达规律不一致。

2. 3 5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶的活性变化

5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶的活性变化情况如图3所示。由图3可知，从5龄起蚕到熟蚕，β-呋喃果糖苷酶活性呈先升高后降低的变化趋势。5龄起蚕到取食第2 d，β-呋喃果糖苷酶活性变化不明显，维持在80.00 U/mg左右，从第3 d开始酶活性开始逐渐升高，第5 d的酶活性最高（158.82 U/mg），随后酶活性逐渐降低，到熟蚕期降至最低（39.25 U/mg）。

3 讨论

家蚕基因组中存在两个β-呋喃果糖苷酶基因（BmSuc1和BmSuc2），其中，BmSuc1基因在家蚕中肠组织中特异性表达，且具有完全酶学功能；BmSuc2基因在家蚕中肠表达量极低，序列比对分析结果显示，BmSuc2基因缺少酶活性位点，故推测其表达产物不具有β-呋喃果糖苷酶活性（Daimon et al.，2008）。本研究利用实时荧光定量PCR检测到BmSuc1基因在5龄家蚕中肠组织均有一定的表达量，其中在5龄起蚕和盛食期的表达量相对较高；而BmSuc2基因在整个5龄期表达量都非常低，几乎检测不到。据此推测，BmSuc1作为一种蔗糖水解酶在家蚕中肠组织消化吸收蔗糖营养物质的过程中发挥主导作用。

家蠶中肠主要是负责营养物质的消化与吸收，桑叶中的大分子如糖类、蛋白质和脂类物质首先在中肠消化液的作用下分解成小分子化合物，经中肠上皮细胞吸收，再通过血液运输到其他组织器官，从而为其生长发育等生命活动提供能量（屠杰和王国基，2005；侯勇等，2007；张赛，2011）。蔗糖是许多昆虫喜好的主要糖类营养来源，昆虫中肠组织的β-呋喃果糖苷酶可将蔗糖分解为葡萄糖和果糖，为机体提供糖源（Krasikov et al.，2001；Barp et al.，2011）。桑叶中的生物碱D-ABI和DNJ等是α-葡萄糖苷酶的强效抑制剂，对非食桑昆虫卷心菜蛾和蓖麻蚕等具有极高的毒性作用（Konno et al.，2006；Hirayama et al.，2007），家蚕却以桑叶作为唯一的食物来源。已有研究表明，家蚕是利用β-呋喃果糖苷酶将桑叶中的蔗糖水解为可利用的单糖，供蚕体吸收利用（Daimon et al.，2008；张蕾，2014）。本研究结果显示，β-呋喃果糖苷酶活性在家蚕的整个5龄期呈先升高后降低的变化趋势，其活性变化规律与该阶段蚕体吸收利用桑叶糖营养的生理进程基本一致，5龄家蚕一般在第4～5 d达到盛食期，β-呋喃果糖苷酶活性即在第4～5 d相对较高，BmSuc1基因表达量也在第4 d最高。盛食期家蚕对桑叶及糖营养的需求量很大，蚕体摄入大量桑叶，即需要更多蔗糖水解酶消化吸收蔗糖营养，此时蔗糖水解酶基因大量表达，其酶活性维持在一个相对较高的水平。

4 结论

BmSuc1基因表达水平及β-呋喃果糖苷酶活性变化规律与5龄家蚕吸收利用桑叶蔗糖营养的生理进程基本一致，提示BmSuc1基因作为一种蔗糖水解酶基因在家蚕中肠组织消化吸收桑叶蔗糖营养物质的过程中发挥主导作用。

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（責任編辑 兰宗宝）