马尾松毛虫高毒力白僵菌菌株筛选

王义勋　王星冉　陈京元　黄俊斌　郑露

摘要：【目的】筛选对马尾松毛虫具有高毒力的白僵菌菌株，为生产上防治马尾松毛虫提供优良菌种资源。【方法】从不同地区林间收集僵虫和采集土壤，分别采用组织分离和稀释涂皿法分离白僵菌菌株，结合形态学观察和ITS序列分析鉴定白僵菌菌株的种级分类地位，通过孢子液浸渍法筛选对马尾松毛虫的高毒力菌株。【结果】共分离获得20株白僵菌菌株，在PDA培养基上各菌株的菌落、菌丝、分生孢子（梗）形态与球孢白僵菌（Beauveria bassiana）相似，且20株菌株ITS序列与GenBank中的球孢白僵菌遗传距离最近。对20株菌株的毒力测定结果表明，B-2、B-14、B-19、B-1和B-13等5株菌株对马尾松毛虫的毒力较强，其中B-2、B-14和B-19菌株的致病力最强，接种11 d后马尾松毛虫的校正死亡率为100%，3株菌株对马尾松毛虫的致死中时（LT50）均小于8.00 d，分别为7.63、7.62和7.88 d，致死中浓度（LC50）分别为0.63×106、0.96×106和0.78×106个/mL。【结论】筛选得到3株对马尾松毛虫具有高毒力的球孢白僵菌菌株B-2、B-14和B-19，且均具有较高的生物防治潜力和开发应用价值。

关键词： 球孢白僵菌；马尾松毛虫；鉴定；毒力

中图分类号： S763.421 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0662-05

Abstract：【Objective】Highly virulent strains of Beauveria bassiana were screened out， in order to provide excellent strain resource for controlling Dendrolimus punctatus in field. 【Method】The dead insect and soil were collected from different woodlands in China， and Beauveria strains were isolated by tissue isolation and gradient dilution method， respectively. Based on morphological observation and ITS sequence analysis， species of all Beauveria strains were identified. And then virulence of Beauveria strains was tested by dipping larvae with spore suspensions. 【Result】A total of 20 Beauveria strains were obtained from dead insect and soil. After being cultured on PDA plates， morphologies of colonies， mycelia， conidia and conidiospores of all strains were observed， and these strains were similar with Beauveria bassiana. Moreover， comparison with sequences in GenBank showed that， the ITS sequences of 20 Beauveria strains were the clos genetic distance with that of B. bassiana in GenBank. The vtrulence determination results showed that， among all strains， the strains B-2， B-14， B-19， B-1 and B-13 had higher vtrulence， especially strains B-2， B-14 and B-19 with the highest virulence， leading to that the corrected mortality of D. punctatus was up to 100% after 11 days post-inoculation. The LT50 of B-2， B-14 and B-19 were 7.63， 7.62 and 7.88 d， respectively， and their LC50 were 0.63×106， 0.96×106 and 0.78×106 conidia/mL， respectively. 【Conclusion】The screened B. bassiana strains B-2， B-14 and B-19 show high virulence to D. punctatus， and have great application and potential in biological control.

Key words： Beauveria bassiana； Dendrolimus punctatus； identification； virulence

0 引言

【研究意義】馬尾松毛虫（Dendrolimus punctatus Walker）属鳞翅目枯叶蛾科昆虫，是我国南方林区的主要森林害虫之一，主要为害马尾松、湿地松等松属植物。其幼虫啃食松针，引起松针卷曲枯黄，严重时可吃光松针，形似火烧，影响松树生长甚至枯死（肖刚柔，1983）。受害后的松树树势衰弱，易遭受天牛、小蠹虫、松茎象等蛀干类害虫入侵，造成松树大面积死亡，威胁森林生态安全（费海泽等，2014）。目前，对马尾松毛虫的防治主要有物理防治、化学防治和生物防治，化学防治虽然在一定程度上可以快速有效地杀灭该虫，但化学农药的长期大量使用严重影响生态环境和人类健康；而物理防治虽具有一定效果，但耗时耗力，不利于大面积防治。生物防治不仅能有效持续杀虫，还不污染环境，能够保持森林生态系统的稳定与平衡。因此，采用生物防治手段对控制马尾松毛虫的发生危害具有重要意义。【前人研究进展】与球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作为一种虫生真菌，能够侵染15目149科的700余种农林业害虫（蒲蛰龙和李增智，1996；李增智等，1998），其中白僵菌的大面积林间应用能够促使对马尾松毛虫的控制达到持续性效果，从而对维护生物多样性及森林生态平衡具有重要意义；而且白僵菌生物制剂对人畜安全、无污染，对害虫不产生抗药性（Feng and Johnson，1990）。我国自20世纪50年代开始研究和应用白僵菌防治林业害虫，其中对马尾松毛虫防治效果最显著。以浙江省为例，20世纪70年代初，白僵菌防治松毛虫仅限安吉、余杭长乐、平阳、丽水等地，70年代末至80年代初，白僵菌防治在浙江省大面积推广，防治效果达70%。近年来也有报道利用白僵菌菌株防治马尾松毛虫取得较好效果。胡凌云和汤均友（2012）的研究结果表明，400亿孢子/g球孢白僵菌可湿性粉剂对马尾松毛虫有较好的防治效果，药后15 d防效在96%。查玉平等（2013）在湖北省采用白僵菌大面积防治马尾松毛虫，无论地面人工防治还是飞机防治效果均较佳，平均防效在60%以上。【本研究切入点】虽然白僵菌应用于马尾松毛虫的防治已有多年历史，但仍存在菌株致病力退化和田间防治效果不稳定等缺点。高毒力菌种筛选和定向培育是白僵菌生产中急需解决的重要课题，也是提高白僵菌对马尾松毛虫防治效果的最佳途径。【拟解决的关键问题】以从我国不同地区林间收集的僵虫和采集的土壤中分离的白僵菌为材料，采用室内马尾松毛虫毒力测定方法筛选出高毒力白僵菌菌株，旨在为生产上防治马尾松毛虫提供可持续使用的优良白僵菌菌株。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

僵虫和土壤采自湖北、福建、吉林等不同地区林间；对照商品球孢白僵菌可湿性粉剂（400亿孢子/g）由江西天人生态工业有限责任公司生产提供；供试健康马尾松毛虫3龄幼虫采集于湖北省红安县马尾松林。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 菌株分离与鉴定

1. 2. 1. 1 菌株分离和保存 僵虫样品采用组织分离法（方中达，2007）分离白僵菌菌株：将林间收集的僵虫表面消毒后切成约0.5 cm小块置于PDA培养基中央，25 ℃恒温培养。土壤样品采用稀释涂皿法（Chase et al.，1986）分离白僵菌菌株：称取2 g土壤样品置于18 mL的无菌水中搅拌2 min制成土壤悬浮液，稀释10倍后涂布于多果定培养基上，25 ℃恒温培养。将分离得到的菌株采用分生孢子单菌落分离获得纯培养菌株，以PDA斜面培养基4 ℃保存备用。

1. 2. 1. 2 菌株形态学鉴定 将上述纯化培养菌株接于PDA培养基上培养，7 d后观察菌落形态特征。采用玻片培养法，记录其菌丝隔膜、孢子形态和大小、产孢梗形状等形态特征。参照相关文献的形态特征进行白僵菌的种级鉴定（Macleod，1954；李增智，1991）。

1. 2. 1. 3 ITS序列分析 采用CTAB法提取各白僵菌菌株的基因组DNA（Sambrook et al.，2001）。rDNA-

ITS区段采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACC

TGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATG

C-3'）进行PCR扩增。反应体系（50.0 μL）：10×Buffer（含Mg2+）5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 3.0 μL，10 μmol/L ITS1和ITS4各1.0 μL，DNA模板2.0 μL， ddH2O补足至50.0 μL。扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ l min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物送至武汉擎科创新生物有限公司进行测序。将测序获得的序列在GenBank中进行BLAST比对分析，然后应用MEGA 5.0软件中的Neighbor- joining法构建系统发育进化树。

1. 2. 2 菌株毒力测定 参照汤强等（2009）的方法对白僵菌菌株进行室内毒力测定。将分离获得的白僵菌菌株分别转至PDA培养基上，于25 ℃恒温产孢培养。12 d后收集孢子，用0.1%吐温-20无菌水配制成1.0×107个/mL的孢子悬液。将野外采集的马尾松毛虫3龄幼虫在配制好的孢子悬液中浸渍10 s，用滤纸吸去多余水分，然后将虫放入装有马尾松松针的广口瓶中，以纱布封口，置于培养箱（25 ℃，RH 90%，L∶D=14 h∶10 h）中饲养。每处理15头幼虫，3次重复。将对照商品400亿孢子/g球孢白僵菌可湿性粉剂稀释至1.0×107个/mL处理作阳性对照，以等量0.1%吐温-20无菌水处理作阴性对照。接种24 h后每2 d统计死亡虫数。死亡的僵虫置于无菌培养皿内25 ℃保湿培养，观察虫体上菌丝生长情况，以区分白僵菌致死和非白僵菌致死。以死亡后虫体表面产生白色菌丝记为被白僵菌感染有效致死，观察菌丝生长及产孢情况，统计死亡率（%），计算校正死亡率（%）、致死中时（LT50）。

1. 2. 3 不同孢子浓度处理马尾松毛虫对菌株毒力的影响 通过1.2.2筛选得到5株毒力较强的白僵菌菌株B-1、B-2、B-13、B-14和B-19，将各菌株孢子分别配制成×106、×107、×108个/mL的3个梯度悬浮液（含0.1%吐温-20），以0.1%吐温-20无菌水作对照。参照1.2.2的方法，对马尾松毛虫3龄幼虫进行不同孢子浓度处理。记录僵虫数量，统计死亡率（%），计算校正死亡率（%）、致死中时（LT50）和致死中浓度（LC50）。

1. 3 统计分析

根据下列公式计算马尾松毛虫死亡率和校正死亡率。以时间（d）的对数值为自变量x，校正死亡率的机率值為因变量y，采用机率值分析法，利用SPSS 19.0计算LT50和回归方程。以孢子浓度（个/mL）的对数值为自变量x，校正死亡率的机率值为因变量y，利用SPSS 19.0计算LC50和回归方程。

2 结果与分析

2. 1 菌株分离和鉴定

从僵虫和土壤中共分离获得20株菌株，其中，从不同寄主的僵虫中分离获得16株菌株；从土壤中分离获得4株菌株（表1）。

在PDA培养基上，供试20株菌株菌落形态相似。培养7 d后菌落白色、圆形，后期菌落变为淡黄色。初生菌丝白色茸毛状，菌落较厚，有褶皱，质地致密柔软；产生分生孢子呈粉末状；菌丝具隔膜、分枝、细长延伸，宽1.60～2.63 μm，隔膜长7.64～l6.50 μm；分生孢子梗多不分枝，呈筒形或瓶形，著生于营养菌丝上；产孢细胞浓密簇生于菌丝、分生孢子梗或泡囊上，呈球形或瓶形，颈部延长形成产孢轴，呈“之”字形弯曲；分生孢子球形或近球形，单孢、无色、透明，着生于产孢细胞延伸而成的产孢轴上。

通过BLAST进行序列比对，结果发现20株菌株ITS序列与球孢白僵菌（B. bassiana）的同源性均在99%以上。采用MEGA 5.0软件Neighbor-joining法构建系统发育进化树，结果（图1）表明，20株菌株序列与GenBank中的球孢白僵菌（登录号AY334539、AY334541和HQ222980）遗传距离最近；与布氏白僵菌（B. brongniartii， 登录号KM458168）、小蝉白僵菌（B. Sobolifera， 登录号AJ309325）、蛹虫草（Cordyceps militaris， 登录号EU825996）和绿僵菌（Metarhizium anisopliae， 登录号KJ573520）等近缘种ITS序列聚类区分明显。鉴于20株菌株的ITS序列同源性较高，排除了混有球孢白僵菌隐含种的可能性（Rehner et al.， 2011）。

結合菌株形态学特征和ITS序列的BLAST比对分析结果，将分离所得的20株菌株鉴定为球孢白僵菌（B. bassiana）。

2. 2 球孢白僵菌菌株毒力测定结果

马尾松毛虫接种孢子悬液处理24 h后开始表现死亡症状，不同菌株对马尾松毛虫毒力存在明显差异，其中，B-2、B-14和B-19菌株接种11 d后校正死亡率达100%。从表2可以看出，菌株B-1、B-2、B-13、B-14和B-19等5株菌株的LT50均小于9.00 d，致死速度相对较快，且5株菌株的LT50比对照商品球孢白僵菌可湿性粉剂（CK）低，其中，B-14和B-2菌株致死速度最快，LT50分别为7.26和7.63 d，其后依次为B-19（7.88 d）、B-1（8.39 d）和B-13（8.71 d）。因此，选取B-2、B-14、B-19、B-1和B-13等5株高毒力菌株进行后续试验。

2. 3 不同孢子浓度对菌株毒力的影响

用供试5株高毒力白僵菌菌株不同浓度分生孢子悬液处理马尾松毛虫幼虫，结果（表3）表明，随着各供试菌株分生孢悬子液浓度的增加，马尾松毛虫幼虫的LT50逐渐降低，分生孢子悬液浓度为1×108个/mL时，供试菌株对马尾松毛虫幼虫的毒力最强，致死速度最快（LT50均小于6.60 d）。从表4可以看出，供试菌株间对马尾松毛虫幼虫的LC50存在差异，其中，B-2菌株的LC50最低，为0.63×106个/mL；B-19与B-14菌株的LC50较接近，分别为0.78×106和0.96×106个/mL， B-1和B-13菌株的LC50较高，分别为4.97×106和7.86×106个/mL。通过上述试验结果分析，筛选出对马尾松毛虫幼虫具有高毒力的菌株B-2、B-14和B-19。

3 讨论

本研究从不同寄主来源僵虫及土壤中分离白僵菌，经鉴定证实所分离菌株均为球孢白僵菌，说明球孢白僵菌在自然界中以优势种群存在，寄生性可能相对其他种类白僵菌更强。利用昆虫病原真菌防治靶标害虫，关键是选择对靶标害虫毒力强的菌株（李会平等，2007；徐进等，2015）。从室内毒力测定结果可以看出，不同白僵菌菌株对马尾松毛虫毒力存在分化，B-2、B-14和B-19菌株对马尾松毛虫的毒力强，接种11 d后校正死亡率达100%，LT50均小于8.00 d。从不同孢子浓度接种试验结果可以看出，菌株的孢子浓度越高，对马尾松毛虫的LT50越短；B-2菌株的LC50最低，为0.63×106个/mL，B-19和B-14菌株的LC50分别为0.78×106和0.96×106个/mL。本研究结果还表明，白僵菌菌株之间存在一定的寄主专化性。分离自马尾松毛虫僵虫的白僵菌菌株比其他寄主的白僵菌菌株的LT50相对偏小，分离自马尾松毛虫的白僵菌对马尾松毛虫的LT50多数小于10.00 d，而分离自尺蠖的B-20和分离自松褐天牛的B-98和B-100对马尾松毛虫的LT50大于20.00 d。不同寄主来源白僵菌菌株毒力存在一定差异，分离自马尾松毛虫僵虫的菌株其毒力普遍较高；而分离自土壤的白僵菌菌株未显示出较强毒力，说明分离自土壤的菌株可能需要通过接种寄主昆虫恢复其毒力。鉴于白僵菌菌株毒力分化明显，因此广泛收集和大量筛选菌株是获得高致病力球孢白僵菌菌株的重要途径。

此外，白僵菌的质量不仅与菌株的毒力有密切关系，还与菌株培养温度、湿度、营养元素等因素及菌株间的多型性和种群遗传异质性等有关系（陈名君等，2010；齐永霞等，2011）。这些特性致使白僵菌在毒力等生物学性状上存在显著差异，进而影响防治效果的稳定性。针对本研究筛选出具有生防潜力的高毒力菌株B-2、B-14和B-19，将进一步对其生物学性状、菌株毒力稳定性及定向培育等方面开展深入研究。

4 结论

本研究从僵虫和土壤中分离获得20株球孢白僵菌菌株，从中筛选出B-2、B-14和B-19等3株对马尾松毛虫具有高毒力的菌株，3株菌株的毒力水平比现已推廣应用的400亿孢子/g球孢白僵菌可湿性粉剂高，具有较高的开发应用价值。

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（責任编辑 麻小燕）