金花茶种子萌发与快速繁殖技术研究

黄昌艳　周主贵　王晓国　卢家仕　关世凯　卜朝阳

摘要：【目的】研究防城港金花茶種子萌發及组培快繁技术，初步建立金花茶组织培养体系，为金花茶的组培快繁利用提供参考。【方法】以金花茶种子为外植体进行组织培养试验，设置3个不同种子的发育程度处理、17个不同培养基的激素浓度处理，测定不同处理对金花茶种子萌发率、增殖系数、株高、叶片数等的影响，筛选出适宜金花茶组培苗生长的萌发、继代和壮苗培养基。【结果】选用胚乳直径大于1.0 cm的金花茶种子接种于MS+GA3 1.0 mg/L培养基中，萌发率可达82.4%；金花茶组培苗增殖系数随6-BA浓度增加呈先上升后下降的变化趋势，当6-BA浓度为3.0 mg/L时增殖系数最大，达3.79；适宜金花茶壮苗生长的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，其平均株高、叶片数、茎粗等均优于其他处理；在黄泥∶泥炭=1∶1组合处理下金花茶组培苗移栽生根率最高，达61%，成活率也较高，为90%。【结论】广西防城港金花茶适宜的种子萌发培养基为MS+GA3 1.0 mg/L、继代增殖培养以MS+6-BA 3.0 mg/L效果较好、壮苗培养基以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L较适宜、黄泥∶泥炭=1∶1作为金花茶组培苗移栽基质最适宜。

关键词： 金花茶；种子萌发；快速繁殖

中图分类号： S685.14 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0611-06

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to investigate seed germination and rapid propagation technologies of Camellia nitidissima from Fangchenggang，Guangxi， and establish its tissue culture system， in order to provide a basis for tissue culture and rapid propagation of C. nitidissima. 【Method】The tissue culture experiment was conducted with C. nitidissima seeds at 3 development degrees as explants and 17 kinds of culture media with different hormone concentrations. Then the effects of these treatments on seed germination rate， multiplication coefficient， plant height and leaf number were investigated， so as to screen optimal medium for multiplication and strengthening seedling culture. 【Result】The results showed that， the selected seeds with endosperm diameter of greater than 1.0 cm were inoculated into culture medium of MS+GA3 1.0 mg/L， and the germination rate was up to 82.4%. The multiplication coefficient first rose and then declined with increase of 6-BA concentration， when 6-BA was at 3.0 mg/L， the multiplication coefficient was up to 3.79. Moreover， the optimal culture medium for strengthening seedlings was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L in this culture medium， the average plant height， average leaf number and average plant height were better than those in other kinds of culture media. When yellow mud/peat ratio in culture substrate for transplantation was 1∶1， the rooting rate of tissue-cultured seedling after transplanting were the highest（61%）， and the survive rate was up to 90%. 【Conclusion】The optimal culture medium for seed germination of Camellia nitidissima from Fangchenggang， Guangxi is MS+GA3 1.0 mg/L， and the optimal culture medium for multiplication is MS+6-BA 3.0 mg/L， the optimal culture medium for strengthening seedlings is MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L， the yellow mud/peat ratio of 1∶1 is optimum in culture substrate for transplantation.

Key words： Camellia nitidissima； seed germination； rapid propagation

0 引言

【研究意义】金花茶（Camellia nitidissima）是世界珍稀观赏植物和种质资源，与银杉、桫椤、珙桐等珍贵“植物活化石”齐名，国外称之为神奇的东方魔茶，被誉为“植物界大熊猫”、“茶族皇后”，观赏价值极高（韦霄等，2010）。金花茶不仅有较高的观赏价值，还具有一定的药用和营养价值，其叶和花为壮族民间用药；此外，金花茶含有特殊的色泽遗传基因，具有重要的科研价值。金花茶组植物在自然状态下的自我繁殖能力较弱，对生长环境的要求较苛刻，而近年来人类对其不合理的采挖和利用导致其生境条件遭受严重破坏，致使金花茶组植物资源种群发展受到严重威胁。为有效保育金花茶组植物种质资源，通过人工快速繁育及栽培，可大力发展金花茶组植物种植业，充分发挥金花茶种质资源的应有价值。【前人研究进展】关于金花茶繁殖方面的研究国内已有一些报道。颜慕勤等（1988）研究了广西7种金花茶的组织培养技术，筛选出适宜的培养基为改良ER培养基（ER培养基的硝态氮含量从472.2 mg/L减为374.6 mg/L，胺态氮含量从210.0 mg/L减为174.2 mg/L），产生胚状体的培养基附加激素量为2，4-D 2.0 mg/L+BA 0.5 mg/L，產生丛生芽的激素为BA 2.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L。杨成华等（1996）和蒋桥生等（2007）均认为金花茶在黄心土的扦插成活率最高。杨泉光等（2013）认为用河沙培育东兴金花茶种子最有利于种苗的发育，其发芽率、苗高、须根数、须根长均优于黄土和珍珠岩所培育的种苗。杨舒婷等（2013）报道崇左金花茶幼嫩叶片愈伤组织诱导的最佳培养基为改良MS+5.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D；幼嫩茎段愈伤组织诱导最佳培养基为改良MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D；种子愈伤组织诱导最佳培养基为改良MS+4.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4-D。邓荫伟等（2014）研究表明，金花茶芽苗砧嫁接除萌的最佳时间以嫁接定植75 d剪除砧木萌芽时留叶2片待30 d再剪除全部砧木萌芽的处理最佳，该处理下嫁接苗成活的保存率、抽梢率均较好。【本研究切入点】目前，已有利用金花茶种子进行组培快繁的研究报道，但不同品种对培养基的要求不同，不同激素对不同金花茶品种的效应也有所不同。【拟解决的关键问题】采用金花茶种子进行组织培养研究，筛选出金花茶适宜的萌发、继代、壮苗培养基，建立其快速繁殖体系，为金花茶的组培快繁利用提供技术依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

选取广西防城港市原生种金花茶7～8成熟、尚未开裂、绿色、饱满、无病虫害的果实为供试材料。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 种子收集及处理 用毛刷刷干净果实表面的杂质，然后用饱和洗衣粉水浸泡20 min，流水冲洗20 min；置于超净工作台用75%酒精浸泡15 min，无菌水洗3次，然后用解剖刀剖开果实，取出种子，放入0.1%升汞中浸泡7 min，无菌水洗4次，最后在接种盘中切开种皮，取出胚乳，接入诱导培养基中，将有胚芽的一端置于培养基底部，操作过程中不得伤及种子胚芽部分。

1. 2. 2 种子发育程度对萌发的影响 将获取的胚乳视发育程度分为3个等级：小（直径小于0.5 cm）、中（直径为0.5～1.0 cm）、大（直径大于1.0 cm）。将种子接入MS+GA3 1.0 mg/L培养基中，60 d后观察种子萌发情况，统计萌发率并测量芽的高度。

培养基均采用MS为基本培养基，琼脂0.45%，蔗糖3.00%，pH 5.8，經121 ℃灭菌23 min后冷却使用；培养条件：光照强度1500～2000 lx，光照时间每天12～14 h，温度（26±2）℃（下同）。

1. 2. 3 不同激素及浓度对种子萌发的影响 选取大小一致的胚乳分别接种到7个处理的诱导培养基（表2）中，60 d后观察种子萌发情况，统计萌发率并测量芽的高度。

1. 2. 4 6-BA对组培苗继代培养的影响 在初始继代培养中，将胚乳及胚芽取出，切掉顶芽及部分胚乳，剩余部分接入继代培养基；切除顶芽后，易产生侧芽，形成芽团，随着胚乳营养的逐步消耗，后期继代培养中切除胚乳。试验过程中，选择芽的高度小于1.5 cm的小芽或芽团接入4个处理的继代培养基（表3）中，接种前统计芽的数量，60 d后观察植株生长情况，并统计总芽量，计算增殖系数。

增殖系数=总芽量/原芽量

1. 2. 5 不同培养基对壮苗的影响 将丛生芽取出，并把高于1.5 cm的小芽切出，接入6个壮苗培养基（表4）中，50 d后观察植株生长情况，测量株高、茎粗，统计叶片数。

1. 2. 6 生根移栽 将壮苗过程中的小苗放置于炼苗室进行炼苗，炼苗温度（25±7）℃，光照强度5000 lx，20 d后移栽。移栽前2 d，打开瓶盖，让小苗适应外部空气湿度；取出小苗，洗去培养基，将小苗的基部置于750 mg/L IBA溶液中浸泡10 min，然后分别种植在纯黄泥、纯泥炭、黄泥∶泥炭=1∶1等3种基质中。调试自动喷淋系统，8：00～18：00期间每间隔1 h喷水1次，每次喷淋30～60 s，根据不同季节调整喷淋时间，一般夏季长、冬季短。60 d后，观察植株生长情况，计算成活率、生根率。

1. 3 统计分析

试验数据采用南京农业大学王绍华设计的STST方差分析软件进行分析和差异显著性检验。

2 结果与分析

2. 1 种子发育程度对萌发的影响

从表1可以看出，胚乳大小对萌发率影响显著（P<0.05，下同），其中小等级处理与中、大等级处理间达极显著差异水平（P<0.01，下同）；芽平均高度在3个等级处理间达极显著差异水平，表现为胚乳直径越大，萌发率越高。直径小于0.5 cm的胚乳，其萌发率只有1.3%；直径大于1.0 cm的胚乳，其萌发率可达89.3%，且萌发的芽粗壮，长出叶片，部分种子长出胚根，根毛多，部分胚芽长侧芽。因此，选用胚乳直径大于1.0 cm的种子作为初代材料萌发率最高（图1）。

2. 3 6-BA对组培苗继代培养的影响

从表3可以看出，随着6-BA浓度的升高，金花茶组培苗的增殖系数先上升后下降，并在3.0 mg/L时达最大值（3.79），其增殖系数与其他处理间达极显著差异水平，此时产生大量侧芽，原芽单株长高变壮，部分叶片伸展（图2）；当6-BA浓度为1.0 mg/L时，产生的侧芽较少；当6-BA浓度为5.0 mg/L时，产生的侧芽不但偏少，而且呈畸形、透明状，生长缓慢，原芽的叶片易卷缩、掉落。因此，适宜金花茶继代增殖的培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L。

2. 4 不同培养基对组培苗壮苗的影响

从表4可以看出，在相同NAA水平下，高浓度6-BA容易使金花茶组培苗长出侧芽，但不利于单株变壮，因此壮苗适合选用较低浓度的6-BA；在低浓度6-BA下，添加0.05 mg/L NAA处理的长势比不添加的长势好，平均株高、叶片数、茎粗均优于不添加的处理，但差异不显著（图3）；在高浓度6-BA处理下添加NAA容易使植株产生愈伤组织，但不利于单株变壮。研究还发现，添加活性炭1.0 mg/L的处理，组培苗的褐化程度降低，表明活性炭有利于减少金花茶在组培过程中因褐化而导致的死亡，但单株长势不如未添加的好。综合考虑，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L最适宜金花茶壮苗生长。

2. 5 基质对金花茶组培苗移栽的影响

从表5可以看出，3种基质中以纯黄泥土处理金花茶组培苗的移栽成活率及生根率均最低，可能是由于纯黄泥的基质黏性太高，透气性差，不利于组培苗生长；纯泥炭处理的金花茶组培苗移栽成活率较高，达92%，但该处理的生根率较低，只有39%；在黄泥∶泥炭=1∶1组合处理下金花茶组培苗移栽生根率最高，达61%，成活率也较高，为90%，添加泥炭能在一定程度上缓解黄泥土黏性太高的缺点，同时该处理的组培苗长势好，根多且壮（图4）。因此，选用黄泥∶泥炭=1∶1作为金花茶组培苗移栽基质最适宜。

3 讨论

随着金花茶市场的日渐走俏，种苗缺口不断扩大，筛选出一种高效、快速的金花茶种苗繁育技术尤为重要。目前，金花茶人工繁殖方法以枝条扦插为主，但枝条扦插繁殖耗费的枝条多，成活率低，繁殖速度慢，不能满足市场的需要，而采用组织培养技术进行金花茶离体培养，可以加快金花茶繁殖速度，并获得大量组培苗。邓桂英（2001）对我国金花茶研究的文献进行了分析，从中得出金花茶研究的学科领域主要集中在遗传育种、形态解剖与分类、种苗和木材等方面，杂交育种、染色体数目和核型、金花茶的分类与系统发育、营养繁殖和组织培养是其研究热点。在金花茶外植体灭菌方面，杨舒婷等（2013）认为幼嫩叶片和种子灭菌的效果较好，幼嫩叶片较好的灭菌方法为洗洁精清洗外植体表面+流水冲洗30 min+75%酒精30 s+

0.1% HgCl2 5 min；种子较好的灭菌方法为洗洁精清洗外植体表面+流水冲洗30 min+75%酒精40 s+0.1% HgCl2 20～30 min+0.2% HgCl2 20 min。李桂娥等（2015）使用的灭菌方法为剥掉金花茶种子种皮，先用75%酒精表面消毒30～60 s，然后用5%～10%的NaClO溶液消毒20～30 min，最后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗。本研究中用75%酒精浸泡果实15 min，无菌水洗3次，然后用解剖刀剖开果实，取出种子，放入0.1%升汞中浸泡7 min，无菌水洗4次，试验中灭菌方法采用保留种皮灭菌，能更好地保护种胚，避免其受到升汞的毒害导致发芽率降低。茎段的消毒相对较难，普遍认为采用分段灭菌的方法效果较好（林莉和赖钟雄，2005；楊舒婷等，2013），幼嫩茎段采用洗洁精清洗外植体表面+流水冲洗30 min+75%酒精25 s+

0.1% HgCl2 10 min+0.2% HgCl2 5 min的灭菌方法好；半木质化茎段采用洗洁精清洗外植体表面+流水冲洗30 min+75%酒精35 s+0.1% HgCl2 12 min+0.2% HgCl2 6 min的灭菌方法好。芽和花苞的消毒最难，采用NaClO原液+HgCl2分段灭菌，并逐次剥去外层苞片进行灭菌的方法也难以达到预期效果。

本研究结果表明，选用胚乳直径大于1.0 cm的种子接种于MS+GA3 1.0 mg/L培养基中，种子萌发率可达82.4%，与周健等（2005）认为GA3能较好地促进茶树芽头生长成为小苗的试验结果相似，但在金花茶组培文章中尚未见试用GA3进行种子诱导萌发的报道。

在愈伤组织诱导方面，金花茶的幼嫩叶片、幼嫩茎段和种子均可以进行愈伤组织诱导。在金花茶茎段离体培养方面，廖汉刃等（1987）报道以改良MS为基本培养基，附加6-BA 0.5～4.0 mg/L+IAA（或IBA）0.5～ 1.0 mg/L，腋芽同样能生长成芽团和无根苗。林莉和赖钟雄（2005）认为在10～11月采摘金花茶的幼嫩茎段较易获得无菌芽，并筛选出适合诱导腋芽萌发的培养基：改良WPM附加2 mg/L 6-BA及0.5 mg/L IAA，萌发率达57.1%，芽苗在附加3 mg/L 6-BA及0.2 mg/L IAA的改良WPM培养基上增殖效果较好；王友生（2013）以3月采集的显脉金花茶茎段為外植体进行研究，其最佳启动培养基配方为WPM+6-BA 7 mg/L+NAA 0.25 mg/L；最佳增殖培养基为： 改良WPM（NO3-∶NH4+=2∶1）+

6-BA 5.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L。本研究筛选出的金花茶继代增殖培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L，未使用生长素。一般来说，在金花茶组培苗快速繁殖时，生长素的水平应低一些，因为高浓度的生长素会导致愈伤组织形成，而愈伤组织的形成会降低增殖系数。同时，高浓度的6-BA能有效降低愈伤组织形成，有利于芽的诱导和生长。在壮苗培养基中，本研究采用的是MS+ 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，与李桂娥等（2015）在专利中使用的IAA 0.5 mg/L差别较大，这两种培养基均能促进金花茶组培苗单株变壮，可能是由于品种不同所致。

生根难是木本植物组织培养中常遇到的难题，主要与植物的基因型、采用的培养基、培养条件有关。在金花茶组培苗生根研究方面，瓶内生根的基本培养基多为1/2MS（廖汉刃等，1987；林莉和赖钟雄，2005），添加的激素及浓度为IBA 3.0～4.0 mg/L或NAA 4.0～6.0 mg/L。李桂娥等（2015）先将获得的金花茶无菌苗基部浸泡于800 mg/L的IBA溶液中15 min，然后转接于MW 生根培养基中进行生根培养，生根率可达98%，根系发达，须根较多，因此今后可采用上述方法进行改进。从金花茶瓶外生根效果看，黄晓娜等（2014）利用200 mg/L IBA浸泡金花茶无菌苗10 min，种植于黄泥∶泥炭土=3∶1基质中，生根率达85%，高于本研究结果，可能是由于本研究选择的激素浓度过高导致生根率低，今后要进行更多的对比试验，筛选适宜的激素浓度、基质配比、移栽方式方法等，选出最优的金花茶瓶外生根方法。

4 结论

本研究初步筛选出MS+GA3 1.0 mg/L、MS+6-BA 3.0 mg/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L可分别作为广西防城港金花茶种子萌发、继代增殖、壮苗的适宜培养基。

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（责任编辑 麻小燕）