枯草芽孢杆菌Czk1诱导橡胶树抗病性相关防御酶系研究

唐文 梁艳琼 许沛冬 张驰成 吴伟怀 郑肖兰 贺春萍 易克贤

摘要：【目的】研究生防枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶树体内防御酶活性的影响，探讨其诱导橡胶树抗病性机理，为Czk1在生物防治领域的应用打下基础。【方法】以过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）5种防御酶作为植物抗病性反应指标，用Czk1菌株发酵液1倍原液及10、100倍稀释液喷洒处理橡胶叶片，以喷洒LB液体培养基为对照，于不同时段测定各防御酶活性；按照生防菌与炭疽病菌接种顺序的不同，测定橡胶树炭疽病菌及生防菌对橡胶植株抗性相关酶活性的影响。【结果】经Czk1发酵液10倍稀释液处理的橡胶树叶片中CAT、POD、PAL和PPO 4种酶活性最高，诱导植株抗病性效果最佳，各酶活峰值分别达4264.62、28946.18、186.67和53.70 U/g，为对照组的5.24、6.34、3.19和3.38倍；而叶片中SOD活性最高的为Czk1发酵液1倍原液处理组，酶活峰值为1344.53 U/g，为对照组的5.19倍。先喷洒Czk1发酵液后接种病原菌的处理组，橡胶树叶片CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性均显著高于其他处理组，各酶活峰值分别为4129.02、640.96、7416.94、173.35和71.59 U/g，为对照组的4.20、2.08、2.50、2.56和7.64倍。【结论】喷施生防菌Czk1稀释液可促使橡胶树抗病相关酶活性升高，诱导橡胶植株产生系统抗性。诱导抗性可能是枯草芽孢杆菌防治橡胶树真菌病害的重要机制之一。

关键词： 枯草芽孢杆菌；橡胶树炭疽病；诱导抗病性；防御酶

中图分类号： S435.76 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）04-0576-07

0 引言

【研究意义】天然橡胶（Hevea brasiliensis）是重要的工业原料，在我国云南、广东及海南等地广泛种植（祁栋灵等，2013）。长期以来，病虫害问题是影响天然橡胶产量的重要因素之一，我国华南垦区橡胶树上已发现40多种真菌病害（詹兴球和蔡江文，2012），其中许多病害普查效率低，难以监测，采用化学方法防治成本高且防效差（李四有和邱学俊，2012）。生防枯草芽孢杆菌具有广谱抗菌活性，在生物农药的研发中应用广泛，但其诱导橡胶树产生抗病性的机理鲜见报道。因此，研究生防枯草芽孢杆菌对橡胶树抗病相关酶系的影响，明确其诱导抗病性机理，可为橡胶树真菌病害的综合防控提供理论依据。【前人研究进展】植物诱导抗病性包括系统获得抗病性（System acquired resistance， SAR）和诱导系统抗性（Induced systemic resistance， ISR），由生防拮抗菌引起的系统抗病性属于ISR（陈志谊等，2001）。近年来，利用内生菌防治植物病害的研究已有广泛报道（Tjamos et al.，2004）。内生细菌诱导植物产生ISR的机制包括诱导寄主细胞物理结构改变和产生生理生化反应变化两方面，其中，生理生化反应变化主要是通过影响植物抗病相关酶的催化活动来实现，涉及的主要防御酶包括过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）等（范志金等，2005）。大量研究表明，生防菌可以诱导上述植物抗病相关防御酶产生变化，从而增强植物抗病能力（Chen et al.，2010），因此，有关芽孢杆菌诱导植物抗病性的研究日益增多（杨瑞先等，2012）。易龙等（2009）研究发现，芽孢杆菌Bn-130菌液可诱导辣椒体内POD、PPO和PAL活性增高。周林等（2011）采用灌根法接种枯草芽孢杆菌TR21发酵液、菌体及发酵上清液后，香蕉根系内POD、PPO和PAL活性均高于空白对照。林陈强等（2013）使用枯草芽孢杆菌CS16发酵液及上清液处理香蕉苗后，均能诱导香蕉叶片中SOD、PPO、PAL和POD等防御酶活性变化。张淑梅等（2014）研究表明，解淀粉芽孢杆菌TF28可诱导提高番茄叶片内防御酶活性，从而抵抗番茄灰霉病的侵染。【本研究切入点】橡胶树病害拮抗枯草芽孢杆菌Czk1分离自橡胶树木质部，室内平板对峙试验结果表明Czk1菌株对13个橡胶树根病菌和炭疽病菌具有强烈的拮抗作用，盆栽试验表明其对橡胶树炭疽病具有良好的生防效果（赵璐璐等，2011），但Czk1菌株的防病机理尚不明确。【拟解决的关键问题】通过测定接种菌株Czk1发酵液及接种橡胶树炭疽病菌RC178处理的橡胶树叶片中CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性变化，明确菌株Czk1诱导植物获得系统抗性情况，进一步丰富该菌株的拮抗机理，为其在生物防治领域的应用打下基礎。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

拮抗细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Czk1，分离自海南省屯昌县中坤农场11队染病橡胶树树根；橡胶树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporiodes）RC178分离自云南景洪县勐养农场。以上菌株均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离、鉴定与保存。供试橡胶种苗品种为热研7-33-97。试验用培养基为LB培养基及PDA培养基。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 Czk1发酵液制备及病原菌活化 挑取活化的Czk1单菌落于50 mL LB液体培养基中，于33 ℃下180 r/min摇床培养过夜，调节菌液浓度至108 CFU/mL作为1倍原液，用无菌水稀释得到10倍稀释液及100倍稀释液。

将橡胶树炭疽病菌RC178接种在PDA培养基上，28 ℃下培养5 d。

1. 2. 2 Czk1发酵液诱导处理 待橡胶苗长至35 cm左右时，选取长势一致的健康植株布置盆栽试验。分别取40 mL不同浓度（1、10和100倍）的Czk1菌液均匀喷洒植株叶面，以喷洒等量LB液体培养基为对照，每处理20株。

1. 2. 3 橡胶树植株防御酶活性测定 分别于处理后24、48、72、96和120 h，按照酶活试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）步骤测定CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性。取0.1 g橡胶树叶片加入提取液在冰上研磨至匀浆，提取粗酶液，按照试剂盒步骤加入试剂。CAT活性测定240 nm处的初始吸光值和1 min后的吸光值；SOD活性测定560 nm处的吸光值；POD活性测定470 nm处30 s时的吸光值和1 min 30 s后的吸光值；PAL活性测定290 nm处的吸光值；PPO活性测定525 nm处的吸光值。根据试剂盒中公式计算各酶活性。

1. 2. 4 橡胶树炭疽病菌及生防菌对橡胶植株抗性相关酶活性的影响 在橡胶苗嫩绿叶期，选择长势一致的健康植株布置盆栽试验。试验设4个处理，每处理20株。处理1，先接病原菌后喷施生防菌（R+C）：将炭疽病菌RC178菌饼（5 mm，下同）接在橡胶树叶片上，每叶片接种4～6个菌饼，24 h后再喷施Czk1发酵液10倍稀释液；处理2，先喷施生防菌后接病原菌（C+R）：每株橡胶苗均匀喷洒Czk1发酵液10倍稀释液40 mL，24 h后接种RC178菌饼；处理3，病原菌处理（R）：将炭疽病菌RC178菌饼接种在橡胶树叶片上，每叶片接种4～6个菌饼；处理4，空白对照（CK）：每株橡胶苗喷施40 mL LB液体培养基。

分别于处理后24、48、72、96和120 h测定叶片中CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性，测定方法同1.2.3。

1. 3 统计分析

试验所得数据用Excel 2007软件整理，采用DPS 7.05统计软件进行分析，用Tukey法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 拮抗菌Czk1对橡胶树幼苗体内抗病相关酶活性的影响

2. 1. 1 CAT活性变化 由图1可知，经Czk1发酵液诱导后，各浓度处理组CAT活性均高于对照，其中，10倍稀释液及1倍原液处理组均表现为酶活性随时间的增加先升高达到峰值后逐渐降低，且CAT酶活性分别在48和72 h达到峰值，活性为4264.62和3939.18 U/g，分别为对照的5.24和2.57倍，与对照间差异极显著（P<0.01，下同）；而经100倍稀释液处理后，橡胶叶片中CAT活性虽然略高于对照，但在72和96 h时与对照差异不显著（P>0.05，下同），也没有明显的上升过程。

2. 1. 2 SOD活性变化 如图2所示，经1倍原液及10倍和100倍稀释液诱导的3个处理组SOD活性变化明显，均表现为先升高后下降的变化趋势，且在诱导后48 h到达峰值，在96 h下降至与对照接近的水平。其中，1倍原液、10倍稀释液两个处理组峰值时的酶活性分别为对照的5.19和5.03倍，分别达1344.53和1302.86 U/g，与对照间差异极显著；100倍稀释液处理组峰值时的酶活性仅为对照的2.34倍，与对照间差异显著（P<0.05，下同）。

2. 1. 3 POD活性变化 由图3可知，经10倍稀释液处理后，橡胶树叶片中POD活性在48～72 h时急剧上升，在72 h时达到峰值（28946.18 U/g），为对照的6.34倍，与对照间差异极显著，随后酶活性缓慢下降；经1倍原液及100倍稀释液诱导后，两个处理组的POD活性先缓慢上升，在96 h达到峰值后下降，峰值分别为对照的3.17和2.10倍，分别与对照间达到极显著和显著差异水平。比较3个处理组POD活性变化，结果发现，10倍稀释液处理组的酶活性显著高于其他两个处理组，诱导效果最佳。

2. 1. 4 PAL活性变化 由图4可知，经10倍稀释液诱导的处理组PAL活性在24～72 h内逐渐增高，72 h活性达到峰值（186.67 U/g），为对照的3.19倍，与对照间差异极显著，随后开始下降；经1倍原液诱导的处理组，PAL活性在48 h出现短暂降低后持续增高，在第96 h时达到峰值，峰值为对照的1.91倍，与对照间差异显著；100倍稀释液处理组与对照相比各时间点酶活性均无显著差异，也无明显峰值出现，表明100倍稀释液可能不能诱导橡胶叶片PAL活性增高。

2. 1. 5 PPO活性变化 由图5可知，经10倍稀释液诱导的处理组，橡胶叶片PPO活性呈先增高后降低的趋势，在48 h达到峰值（53.70 U/g），为对照的3.38倍，与对照间差异极显著，诱导效果最佳；经100倍稀释液诱导的处理组，PPO活性也在48 h达到峰值，但与对照间差异不显著，峰值为对照的1.60倍，而后緩慢降低至与对照接近的水平；经1倍原液诱导的处理组，PPO活性在处理后24 h即达到较高水平，且高于其他两个处理组，但在随后的时间内没有发生明显变化，PPO活性在30.00 U/g上下波动，没有出现明显峰值，诱导效果与10倍液处理组有明显差别。

2. 2 橡胶树炭疽病菌RC178及拮抗菌Czk1对橡胶植株抗性相关酶活性的影响

2. 2. 1 橡胶树叶片CAT活性变化 测定生防菌及病原菌共同处理后橡胶叶片中抗性防御酶CAT活性，结果见图6。3个处理组CAT活性均高于空白对照，其中，先接种生防菌Czk1再接种病原菌RC178的处理组的CAT活性与其他各处理间差异达极显著水平，其在24～72 h时酶活性不断上升，在72 h时酶活性达到峰值（4129.02 U/g），为对照的4.20倍，随后酶活性逐渐降低；先接种病原菌再接种生防菌后，橡胶叶片CAT酶活性在48 h时达到峰值（2223.84 U/g），为对照的3.12倍，与对照间差异极显著，但在72～120 h时降低至与对照接近的水平；只接种病原菌后，橡胶树叶片CAT活性在各时间段均在1000.00 U/g上下波动，没有明显的活性峰，CAT活性虽然高于对照，但在72 h时与对照差异不显著。

2. 2. 2 橡胶树叶片SOD活性变化 由图7可知，3个处理组SOD活性均高于空白对照，均呈先增高后降低的趋势，且均在72 h达到峰值，其中，先接生防菌再接病原菌的处理组SOD活性峰值最高，达640.96 U/g，为对照的2.08倍，与对照间差异极显著；先接病原菌再接生防菌的处理组SOD活性峰值为515.18 U/g，是对照的1.67倍，与对照间差异显著；只接种病原菌的处理组SOD活性峰值为392.04 U/g，仅为对照的1.27倍，与对照间差异不显著。

2. 2. 3 橡胶树叶片POD活性变化 由图8可知，先接种病原菌的处理组POD活性在48～72 h内与对照差异显著；只接病原菌的处理组POD活性变化平缓均在3500.00 U/g上下波动，在24和48 h时与对照差异不显著，在72～120 h时差异显著；而先接种生防菌再接种病原菌的处理组POD活性变化明显，在24～72 h内不断增加，在72 h时达到峰值（7416.94 U/g），为对照的2.50倍，且与其他各处理组间差异达极显著水平。

2. 2. 4 橡胶树叶片PAL活性变化 由图9可知，经生防菌和病原菌共同诱导的2个处理组PAL活性均高于其他处理组，酶活性变化表现为先增高再降低的趋势，且均在72 h达到峰值，其中先接种生防菌的处理组PAL活性峰值最高，达173.35 U/g，为对照的2.56倍，与对照间差异极显著；先接种病原菌的处理组PAL活性峰值为130.62 U/g，为对照的1.93倍，与对照间差异显著；只接种病原菌的处理组PAL活性在48～120 h内与对照间差异不显著。

2. 2. 5 橡胶树叶片PPO活性变化 由图10可知，处理后48 h，先接种病原菌再接种生防菌的处理组PPO活性最先升高达到峰值（52.80 U/g），为对照的4.47倍，与对照间差异极显著，随后酶活逐渐降低；先接种生防菌再接种病原菌的处理组PPO活性在72 h到达峰值（71.59 U/g），高于所有处理组，为对照的7.64倍，与对照间差异极显著；只接种病原菌的处理组PPO活性略高于对照，在48和96 h时与对照差异显著，其他时间段内均与对照间差异不显著，其酶活性随时间变化平缓，没有出现明显的活性峰。

3 讨论

当植物受病原菌侵染或诱导处理后，与抗病反应相关的保护性酶活性升高是诱导抗性产生的重要机制之一，其中CAT、SOD、POD、PAL和PPO是植物体内与抵制病原微生物侵染有关的重要酶，其活性的变化通常作为衡量植物体内防卫反应的重要指标（Ehret et al.，2010）。

CAT作为生物防御体系的关键酶之一，是重要的活性氧清除剂，可以清除植物体内的过氧化氢（张先成等，2009）。本研究中，枯草芽孢杆菌Czk1发酵液10倍稀释液处理后橡胶叶片CAT活性更早达到峰值（4264.62 U/g）。先接种生防菌再接种病原菌后，橡胶树叶片CAT活性显著高于其他处理组，与彭灿（2013）的研究结果一致。

SOD也是主要的活性氧清除酶，能够避免活性氧在植物体内大量产生和积累（庞学群等，2008）。本研究结果显示，经枯草芽孢杆菌Czk1发酵液10倍稀释液处理48 h后，橡胶树幼苗体内SOD活性达到峰值，为1302.86 U/g。在接种枯草芽孢杆菌Czk1和橡胶炭疽菌RC178后，各处理以先接生防菌再接病原菌的处理组SOD活性峰值最高，与陈志谊等（2001）将水稻接种拮抗菌B-916与水稻纹枯病菌后SOD活性无明显变化的研究结果不同，可能是炭疽病菌RC178的侵染使得橡胶植株中活性氧含量升高所致。

POD属于PR-9蛋白家族，可催化形成木质素，加固植物细胞壁，从而抵抗病原物的入侵，同时也能清除细胞内的活性氧（林陈强等，2013）。本研究中经枯草芽孢杆菌Czk1发酵液10倍稀释液处理的橡胶植株，叶片中POD活性显著高于其他浓度处理，峰值达到28946.18 U/g，与傅莹等（2011）的研究结果相似，说明提高菌液浓度并不一定能诱导植株防御酶活性升高，拮抗菌液浓度与诱导植物产生抗性的效果并非正相关。同时，先接种生防菌Czk1再接种病原菌，橡胶树叶片中POD活性显著高于其他处理组，说明在病菌侵染植株之前接种生防菌有利于诱导抗病性。

PAL是苯丙烷类代谢中的关键酶，植物在受到病原菌侵染或激发子刺激后，PAL活性首先上升（王淑霞等，2013）。本研究结果显示，枯草芽孢杆菌Czk1发酵液10倍稀释液能够更快地诱导橡胶植株叶片内PAL活性增高，提高抗病性；先接种生防菌再接种病原菌的处理PAL活性最高，诱导效果最好。周林等（2011）使用灌根法将枯草芽孢杆菌TR21发酵液接种到香蕉植株后，香蕉根系PAL活性出现两次高峰且始终保持在较高水平，与本研究中PAL活性只出现一次高峰不同，究其原因可能是不同接种方法对PAL活性影响不同。

PPO一方面能催化产生木质素和酚类氧化产物，构成保护性屏障，抵抗病原菌的入侵，另一方面能催化酚类物质氧化形成高毒性的醌类物质，直接作用于病原菌（刘淑宇等，2013）。本研究中，经Czk1发酵液10倍稀释液处理的橡胶植株，其叶片内PPO活性显著高于其他浓度处理，峰值达53.70 U/g。陈志谊等（2001）将拮抗菌B-916与纹枯病菌RH-2接种于水稻植株，研究水稻组织中PPO活性变化，结果发现，只接种病原菌的处理组PPO活性最先达到峰值，且峰值高于其他各处理组；本研究中只接种病原菌的处理橡胶叶片中PPO活性首先达到峰值（52.80 U/g），与陈志谊等（2001）的研究结果相似，但先接种生防菌再接种病原菌的处理组PPO活性最高，与陈志谊等（2001）的研究结果不同，说明拮抗菌Czk1与拮抗菌B-916相比，能够更好地诱导植株PPO活性增高，增强植株抵御病原菌的能力。

在本研究中，生防菌Czk1發酵液可影响橡胶树叶片中CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性变化，诱导橡胶苗产生系统抗性，但对其发酵液在田间的防病效果还有待评价。因此，后续的研究有必要通过大田试验以明确其抗病潜能，验证其抗性诱导机理，为实现该菌株的开发应用提供技术支持。

4 結论

本研究结果表明，拮抗细菌Czk1可诱导橡胶植株抗性相关防御酶的变化，拮抗菌液浓度与诱导植物产生抗性的效果并非正相关，其中10倍稀释液诱导效果最佳；在植株受到病原菌侵染前喷洒Czk1发酵液，对橡胶苗叶片内防御酶活性影响最大，更有利于诱导抗病性。因此，诱导抗性可能是枯草芽孢杆菌防治橡胶树真菌病害的重要机制之一。

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（责任编辑 麻小燕）