香蕉中2条MaMLO基因的克隆及表达分析

贾彩红 王卓 李健平 金志强 徐碧玉

摘 要 MLO基因是一类植物特有的抗病基因，为了研究香蕉MLO基因在香蕉抗枯萎病中的作用，利用RACE技术从香蕉中克隆获得了香蕉2条MLO基因，分别命名为MaMLO1和MaMLO2。序列分析表明，MaMLO1的开放阅读框为1 473 bp，编码490个氨基酸；MaMLO2的开放阅读框为1 689 bp，编码562个氨基酸。系统进化树分析表明，MaMLO1与已登录的香蕉MLO1（XP_009413424）亲缘关系较近，MaMLO2与已登录的香蕉MLO6（XP_009411538）亲缘关系较近。组织特异性研究表明，这2个基因在香蕉各器官中均有表达，但MaMLO2在根中的表达量最大。不同激素处理下的研究表明，MaMLO1受ABA、乙烯和水杨酸诱导上调表达，受茉莉酸诱导下调表达；MaMLO2受ABA、乙烯、水杨酸和茉莉酸4种激素诱导上调表达。在感病品种中2个基因均是下调表达，在抗病品种中均是上调表达。结果表明，克隆到的2条MLO在感病品种中没有参与到香蕉抗枯萎病的过程，而在抗病品种中参与了香蕉抗枯萎病的过程。

关键词 香蕉；MaMLO基因；克隆；表达分析

中图分类号 S668.2 文献标识码 A

Abstract MLO is a kind of disease resistance genes in plant. In order to study the role of MaMLO in banana blight resistance， two MaMLOs named MaMLO1 and MaMLO2 were cloned from banana using the RACE technology. Sequence analysis showed that MaMLO1 had an open reading frame of 1 473 bp， encoding 490 amino acids； MaMLO2 had an open reading frame of 1 689 bp， encoding 562 amino acids. Phylogenetic tree analysis showed that MaMLO1 was close affinity to MLO1（XP_009413424）， MaMLO2 was close affinity to MLO6（XP_009411538）. Tissue specificity study showed that the two genes expressed in all organs of banana， but the biggest expression quantity of MaMLO2 was in the root. The study showed that the expression of MaMLO1 was induced to raise by ABA， ethylene and salicylic acid， while was induced to reduce by jasmonic acid； The expression of MaMLO2 was induced to raise by ABA， ethylene， salicylic acid and jasmonic acid. The expression of MaMLO1 and MaMLO2 was induced to reduce in cultivars， but raised in disease-resistant varieties. The results showed that the two MaMLOs were not involved in the process of the banana cultivars blight resistance， but they involved in resistant varieties.

Key words Banana； MaMLO； Cloning； Gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.007

香蕉是热带、亚热带发展中国家重要的农作物之一。其果实由于富含丰富的蛋白质和碳水化合物，是一些热带地区人民的主要粮食和国民收入的主要来源[1]。而香蕉枯萎病被认为是香蕉的“癌症”，严重影响着香蕉的产量和质量。香蕉枯萎病是一种典型的土传病害，是世界范围内限制香蕉种植和产量的主要原因。该病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense，Foc）引起的毁灭性土传维管束病害，广泛分布于世界各大香蕉主产区。香蕉易感枯萎病的机理十分复杂，其研究涉及到病理学、解剖学、生理学、生物化学和分子生物学等多个学科。有研究显示枯萎病的发生是由于病原菌通过根系侵入植株输导组织，病原体在木质部的导管中大量繁殖，这些繁殖体可以在蒸腾压力的作用下随导管运输，随着病原体的大量增殖，增殖的病原菌体可由一个导管运输到另一个导管，大量繁殖的病原菌在导管内形成凝胶体，受感染的宿主分泌酚类化合物使堵塞的导管木质化而死亡[2]。

MLO基因家族是一类植物特有的抗病基因，是一个多基因家族，MLO基因对植物的抗病过程起负调控作用，在一定程度上相当于植物“感病”基因。任何感病的野生型（MLO）都可以通过诱变获得MLO抗性。因此这类基因在改善植物抗性方面具有更大的潜力和应用前景。不同植物中的MLO基因拷贝数不同，拟南芥有15个[3]，水稻有12个[4]，高粱有13个[5]，葡萄有17个[6]，黄瓜有14个[7]。对不同物种的MLO基因结构和功能进行分析发现，MLO是一类比较保守的抗病基因。近年来部分物种的MLO基因在抗病中的功能已经得到验证，包括水稻[8]、小麦[8-9]、拟南芥[10-11]、辣椒[12]等。

目前对MLO基因的研究主要集中在与白粉病相关的研究，而未见与香蕉枯萎病的相关报道，与激素、非生物胁迫相关的研究报道也较少。本研究从枯萎病菌（尖孢镰刀菌生理4号小种）处理的巴西蕉根转录组中获得了2个MLO基因片段，通过RACE技术从香蕉中获得2条MLO基因全长序列，对其序列进行生物信息学分析，对在不同激素处理、香蕉感病品种和抗病品种中的表达进行分析研究，以期为香蕉MLO基因在香蕉抗病分子育种中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

香蕉（Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian）的根、茎、叶、花和果实（开花后100～120 d）从中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈香蕉种植园获得。五叶一心的巴西蕉和抗病品种GCTCV119（M. acuminata L. AAA group，cv. Cavendish）从儋州香蕉组培苗厂购买获得。

1.2 方法

1.2.1 激素处理 选取生长势一致的五叶一心的巴西蕉，用100 mol/L的ABA溶液，100 mol/L的茉莉酸溶液，100 mol/L水杨酸溶液和1%（V/V）乙烯利溶液处理24 h后取样，分别在0、6、12、24 h取样，液氮速冻后于-70 ℃冰箱待用。每个处理重复3次。

1.2.2 菌液处理 分别选取生长势一致的感病品种巴西蕉和抗病品种GCTCV119，利用Foc TR4侵染香蕉，香蕉植株在Foc TR4浓度为1.5×106 condia/mL的孢子悬浮液中浸泡2 h后，置于与上述培养条件相同的环境中培养，分别在0、2、4、6 d取样（DPI）[13]，液氮速冻后保存于-70 ℃冰箱待用。每个处理重复3次。

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成 香蕉各种组织RNA的提取采用改良的CTAB法[14]。每个样品取4 μg RNA，利用Invitrogen SuperScript TM IIIReverse Transcriptase合成cDNA第一链，具体反应体系和操作根据说明书进行。

1.2.4 香蕉MaMLO基因的克隆 RACE方法克隆香蕉中的MaMLO，根据已获得的3′端完整的cDNA片段设计5′端引物（表1）。SMART RACE Kit 扩增5′端序列。拼接后，设计全长扩增引物（表1）利用香蕉根系cDNA文库扩增全长序列。反应程序为：94 ℃变性7 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。获得的序列利用BLASTn进行分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn），推导的氨基酸序列与香蕉DH-Pahang（AA组）基因组数据库（http：//banana-genome.cirad.fr/greenphyl）进行比对，系统发育树构建使用MEGA4[15]。

1.2.5 半定量RT-PCR 利用半定量RT-PCR对MaMLO基因在香蕉不同器官中的表达进行分析。所需引物见表1。PCR反应条件94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃终延伸10 min。MaActin作为内对照，每个反应重复3次。

1.2.6 荧光定量PCR 利用荧光定量PCR对MaMLO基因在枯萎病菌下处理后的表达进行分析。反应体系为：12.5 μL的2XSYBR Green PCR Master Mix，0.5 μL的ROX，100 ng的反转录RNA。所需引物见表1。反应程序为：94 ℃ 预变性3 min，94 ℃变性7 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。MaActin作为内对照，每个反应重复3 次。

2 结果与分析

2.1 基因的特征分析

对获得的基因进行分析发现，MaMLO1基因的开放阅读框为1 473 bp，编码490个氨基酸，MaMLO2基因的开放阅读框为1 689 bp，编码562个氨基酸，这2条基因中均含有7个跨膜区，符合MLO基因的典型特征（图1），因此将其命名为MaMLO。将克隆获得的基因与2A基因组中的MLO基因进行比对，本研究中克隆获得的MaMLO1基因与已经登录的香蕉中的MLO1基因在核苷酸水平上的同源性为99.39%，氨基酸水平上的同源性为94.69%；与2A基因组中的MLO基因核苷酸水平上同源性为94.69%，氨基酸水平上的同源性为98.78%，MaMLO2与2A基因组中的MLO基因核苷酸水平上同源性为99.35%，氨基酸水平上的同源性为99.11%，与NCBI中已登录的MLO6基因核苷酸水平上同源性为99.35%，氨基酸水平上的同源性为99.11%（表2）。说明克隆得到的这两个基因是香蕉中的MLO基因。

构建遗传进化树发现，MaMLO1与已经登录的香蕉中的MLO遗传进化关系最近，与其他植物中的MLO的遗传关系也比较近；而MaMLO2与已登录的香蕉中的MLO6在同一分支上，与香蕉中MaMLO1遗传关系较远，与其他植物中的MLO遗传关系也较远（图2）。

2.2 基因的器官特异性表达

利用半定量RT-PCR对MaMLO1和MaMLO2在香蕉不同器官中的表达进行分析，结果表明，MaMLO1在根、茎、叶、花和果中均有表达，但表达量变化不明显，MaMLO2在根中的表达量最大，在茎、叶、花和果中的表达量基本一致（图3）。

2.3 不同激素处理下的表达分析

利用荧光定量PCR技术对MaMLO1和MaMLO2在不同激素处理后根中的表达进行分析，发现MaMLO1受ABA和乙烯胁迫均是先下调表达，随后上调表达，其表达情况成“V”字形状；而在水杨酸胁迫下是先上调表达，随后下调表达，在12 h其表达量最大，相对表达量为2.87；在茉莉酸胁迫下，其表达是下调的。MaMLO2均受ABA、乙烯、水杨酸和茉莉酸4种激素诱导上调表达，且表达量变化显著，ABA、乙烯和茉莉酸诱导相对表达量最大值均出现在24时，分别为5.90、27.89、和18.95，而水杨酸诱导的最大值出现在12时，其相对表达量最大值为17.46（图4）。

2.4 不同香蕉品种中的表达分析

对MaMLO1和MaMLO2在香蕉感病品种和抗病品种接种Foc TR4后的表达进行分析，发现在感病品种2个基因均是诱导下调表达，且下调表达量均呈极显著差异，MaMLO2下调表达量比MaMLO1的下调表达量更大，MaMLO1的最小相对表达量为0.19，MaMLO2的最小相对表达量为0.13。在抗病品种中，这2个基因均是诱导上调表达，MaMLO1的相对表达量变化不明显，MaMLO2的相对表达量变化在2 d和6 d呈极显著差异，在4 d呈显著差异，且最大值出现在6 d，为3.05（图5）。

3 讨论与结论

自从MLO基因在大麦中被发现以来，人们陆续在很多作物中发现了MLO基因，而原核生物、酵母和动物中均未发现该类基因的存在，说明MLO基因是植物所特有的。已有研究成果表明，MLO在许多作物里呈家族形式，具有多个家族成员，其中拟南芥中有15个家族成员、玉米中有9个、水稻中有12个家族成员，而在测序的香蕉2A基因组中有24个。研究中，克隆了香蕉中的2个MLO基因，推导的氨基酸编码的MLO蛋白均具有跨膜结构，满足MLO基因的基本特征；系统进化树表明，本研究中克隆的MLO基因与NCBI中已登录的香蕉MLO1基因和MLO6基因的同源性分别为99.39%和99.35%，但2个基因的长度不同，氨基酸同源性也较低，遗传关系较远，表明这2个基因属于不同的亚家族，MaMLO1和MaMLO2在香蕉中所起的作用可能不同。

利用半定量PCR研究香蕉中的MLO基因在不同器官中的表达，MaMLO1在香蕉的根、茎、叶、花和果中均有表达，但在各组织中的表达量差别不明显，而MaMLO2在根中的表达量较高，在其他器官中的表达量相对较低，说明该基因属于组织特异性表达模式，可能与香蕉枯萎病相关。苹果中与白粉病相关的MLO基因，其表达量在根中最大[23]，本研究结果与其有相似之处，即与病相关的MLO基因在根中的表达量最大，但苹果白粉病是发生在叶片上，而香蕉枯萎病发生在根系中，其不同之处需进一步研究证明。

目前已有关于MLO基因在不同激素处理、不同胁迫处理后表达情况的研究报道。例如：小麦[16]、水稻[17]、甜瓜[18]、辣椒[19]和葡萄[20]中均有报道。辣椒中的MLO基因，受黄单胞菌诱导上调表达，在水杨酸、甲基紫精、氯化钠和干旱处理后，其表达量也上调，但茉莉酸处理的其表达量下调[19]。说明辣椒的MLO基因不仅参与了抗病途径，在非生物胁迫和激素胁迫方面也起作用。葡萄中不同的MLO基因，在伤害处理、水杨酸处理和双氧水处理后，不同的MLO基因的表达模式不同，有的上调，有的下调，说明植物体内不同的MLO基因所起的作用不同[20]。本研究中香蕉中的MaMLO1和MaMLO2基因在不同激素处理后的表达模式有所不同，表明这2个基因在香蕉中对激素的反应不同。这与在辣椒和葡萄中的研究相似，即不同的MLO基因在植物体内所起的作用不同，说明不同植物中的MLO基因对不同胁迫处理的反应不同，所起的作用也不同。本研究中香蕉的2个MLO基因在4种激素处理后的表达结果说明，MaMLO2基因响应不同激素的程度均大于MaMLO1基因，说明在香蕉对外界激素反应强度方面，MaMLO2基因对激素的反应程度大于MaMLO基因，表明在香蕉反应激素方面MaMLO2的作用大于MaMLO1的作用。以上结果表明，植物的MLO基因不只与植物的抗病相关，可能与植物的非生物胁迫、植物的生长发育有关，体现了MLO基因功能上的多效性。

已有研究表明，MLO基因属于抗病基因，在抗病过程中起负调控作用，小麦中的感病品种用白粉病菌处理后MLO基因的表达量在24 h后开始上升，72 h达到高峰，而在抗病品种中其表达量在18 h即出现了表达高峰，表明在抗病品种中MLO基因可能直接参与了抗病反应[21]。在苹果中研究发现，在感染白粉病的茎段和叶中其表达量比健康的茎段和叶中表达量均有所增加[22]，这与我们的研究结果不同。本研究中发现，香蕉的感病品种和抗病品种用枯萎病菌处理后，在感病品种中，2个MLO基因的表达量下调，而在抗病品种中2个MLO基因的表达量上调，说明在香蕉感病品种中这2个MLO基因可能没有参与到抗病反应中，而在抗病品种中可能参与了抗病反应，这与小麦中的研究结果不同。在香蕉感病品种中，MLO基因的表达量一直是下调，在抗病品种中一直上调，而在小麦感病品种和抗病品种中都是先上调随后下调，这可能与不同的植物病害有关，白粉病是发生在叶片上的一种病害，而枯萎病是发生在根系中的一种病害，2种病害发生机制不同，推测MLO基因在不同的抗病途径中所起的作用不同，小麦中的TaMLO8基因在小麦条锈病和白粉病两种病害系统中所起的作用不同[23]也证明了这一点，但还需要进一步的研究证明。

本研究从香蕉中获得了2条MLO基因，对其基因和推导的氨基酸序列进行了一些分析，对其组织研究表明，这2个基因参与了香蕉的生长发育过程；其对不同激素胁迫和香蕉枯萎病的响应说明这2个基因不仅响应非生物胁迫，而且响应生物胁迫。

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